建立牛胚胎体外生产体系和快速鉴定胚胎性别的方法

论文摘要

本论文主要研究了体外生产牛胚胎和一种新的牛胚胎性别鉴定方法-环介导恒温扩增法,为胚胎生产积累了宝贵的资料。具体内容包括以下几部分:1.本研究比较了牛卵母细胞成熟时间、卵丘-卵母细胞复合体（COCs）的分级、雌激素（E2）浓度以及来源于不同大小卵泡对卵母细胞成熟效率的影响。结果表明:（1）24 h成熟的卵母细胞卵裂率显著高于21 h和27 h,同时囊胚率也显著提高（P<0.05）。（2）A级和B级卵母细胞的卵裂率和囊胚率显著高于C级和D级卵母细胞（P<0.01）)。（3）在成熟液中添加1μL/mL E2（雌激素）后,卵裂率和囊胚率显著高于10μL/mL组（P<0.01）,但与对照组差异不显著。（4）采自2～8 mm卵泡的卵母细胞卵裂率显著高于采自小于2 mm组和大于8 mm组（P<0.01）,囊胚率也显著高于小于2 mm组（P<0.05）,但与大于8 mm组差异不显著。因此,研究认为卵母细胞成熟24 h,细胞胞质和细胞核都已经充分成熟;A级和B级卵母细胞可用做生产体外胚胎;在成熟液中添加1μL/ mL E2能增加卵母细胞的核成熟率,但是高浓度则抑制胚胎发育;源于2～8 mm卵泡的卵母细胞成熟24 h后受精,适宜胚胎发育,且发育良好。2.研究了在卵母细胞成熟液中,添加来源于不同直径卵泡液[小（<3 mm）、中（3～6 mm）和大（6～12 mm）]的成熟卵母细胞,观察排出极体和胚胎发育情况。发现在成熟液中添加中、大卵泡液能显著提高卵母细胞的第一极体率（P<0.05）,而且添加50%大卵泡,还促进了孤雌激活胚胎的发育,但是降低体外受精胚的卵裂率（P<0.05）。说明添加50%大卵泡液（6～12 mm）对卵母细胞胞质成熟有促进作用,但是不利于受精。为了有效提高卵母细胞的成熟率,本试验分两步进行:第一步,于成熟液中添加50%的大卵泡液,让卵母细胞成熟数小时。第二步,于成熟液中添加10%的FBS,再成熟24 h。结果表明,两步成熟法,有效的提高了胚胎的卵裂率和囊胚率,特别是第一步成熟6 h,获得84.7%卵裂率和44.7%的囊胚率（P<0.05）。3.本试验研究了颗粒细胞在体外受精中的作用。结果表明COCs受精率、卵裂率和囊胚率极显著高于裸卵（P<0.01）;颗粒细胞和裸卵混合,受精率和囊胚率显著高于（P<0.05）裸卵组;输卵管上皮或颗粒细胞与裸卵混合后受精,二者卵裂率和囊胚率差异不显著;在受精液中添加100 ng/mL孕酮,COCs组卵裂率和囊胚率没有变化,但是裸卵组,受精率和囊胚率有一定程度的提高;COCs在20% O2的卵裂率和囊胚率比在5% O2有显著的增加（P<0.05）,但是裸卵在这两种气相条件下,没有变化。结果表明,颗粒细胞在体外受精中具有独特作用,尤其是与卵母细胞形成复合体的作用更大。分析是因为受精时,颗粒细胞分泌孕酮和增加氧自由基,从而提高受精效率和后期胚胎发育潜力。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 体外生产牛胚胎的研究进展
• 1.1 卵母细胞体外成熟（IVM，IN VITRO MATURATION）
• 1.2 体外受精（IVF ，IN VITRO FERTILIZATION）
• 1.3 胚胎培养（IVC，IN VITRO CULTURE）
• 1.4 小结
• 第二章 哺乳动物性别控制研究进展
• 2.1 哺乳动物的性别决定的生物学机制
• 2.2 性别控制方法
• 2.3 PCR 法进行早期胚胎性别鉴定技术的进展
• 2.4 国内研究现状及存在问题
• 2.5 结束语
• 第三章 牛卵母细胞的体外成熟
• 3.1 试验材料与方法
• 3.2 结果
• 3.3 讨论
• 3.4 小结
• 第四章 两步成熟法对卵母细胞成熟的影响
• 4.1 材料与方法
• 4.2 结果
• 4.3 讨论
• 4.4 小结
• 第五章 颗粒细胞在体外受精中的作用
• 5.1 材料与方法
• 5.2 结果
• 5.3 讨论
• 5.4 小结
• 第六章 体外受精方法的研究
• 6.1 试验材料与方法
• 6.2 结果
• 6.3 讨论
• 6.4 小结
• 第七章 牛体外受精胚胎培养条件的优化
• 7.1 材料与方法
• 7.2 结果
• 7.3 讨论
• 7.4 小结
• 第八章 体外生产牛胚胎体系稳定性试验
• 8.1 材料与方法
• 8.2 结果
• 8.3 讨论
• 8.4 小结
• 第九章 环介导恒温扩增方法的研究
• 9.1 材料与方法
• 9.2 结果
• 9.3 分析与讨论
• 9.4 小结
• 第十章 环介导恒温扩增结果的快速鉴定
• 10.1 试验材料与方法
• 10.2 结果
• 10.3 讨论
• 10.4 小结
• 第十一章 环介导恒温法在牛胚胎性别鉴定中的应用
• 11.1 材料与方法
• 11.2 结果
• 11.3 讨论
• 11.4 小结
• 本论文的创新点
• 参考文献
• 附图
• 致谢
• 个人简介