论文摘要
近年来,国际上逐步发展起了一种新的基因疫苗载体系统,称为复制型DNA疫苗,克服了常规DNA疫苗免疫力低下、安全方面不能保障的缺陷,同时又保留了DNA疫苗稳定、低成本的优点,因而成为开发治疗性疫苗最好的技术途径之一。本研究室前期自主开发了基于塞姆利基森林病毒SFV的复制子DNA疫苗载体系统（可复制型DNA疫苗）,并用于肿瘤疫苗及乙肝疫苗等新型治疗性基因疫苗的研究。所谓可复制型DNA疫苗,是在RNA复制子疫苗基础上发展演化而来的一种新型DNA疫苗系统。与常规DNA疫苗相比,可复制型DNA疫苗利用RNA复制酶,在细胞中具有自我复制能力,介导RNA复制子在细胞质中进行大量自我复制,因此外源基因可以得到高效表达。同时RNA大量自我复制过程中,产生的双链RNA是强效天然免疫佐剂,使可复制型DNA疫苗免疫效力远远高于常规DNA疫苗,用量可降低到传统DNA疫苗的100倍以下。再有,该疫苗的自我复制、转录表达均发生于细胞质中,最终会诱导被转染细胞凋亡,从而消除了与宿主细胞基因组整合的危险性,大大提高了基因疫苗的安全性。而且,这种疫苗以类似脉冲的形式刺激机体免疫系统,能够有效克服免疫耐受。为了进一步提高复制子DNA疫苗抗原的递送效率和免疫效果,本研究将复制子载体包装成为甲病毒颗粒样疫苗,同时还对所制备颗粒进行DC靶向化改造。病毒颗粒这种疫苗形式,除了具备复制子疫苗的全部优点外,还可以使其包装的复制子DNA免受核酸酶的降解,增强抗原进入细胞的效率,充分发挥病毒样颗粒本身的免疫学特性。同时,通过对这种重组的甲病毒颗粒疫苗进行DC靶向化改造,在体内选择性感染DC细胞,进一步增强DC细胞对抗原的吞噬、加工和递呈功能,从而提高疫苗激发特异性免疫应答的效果,最终提高疫苗的免疫效力。首先,本研究以基于SFV的含有红绿荧光蛋白报告基因的复制子DNA表达载体pSCK-EGFP-IRES-dsRED为基础,通过与辅助载体pSHCAR共转染,由pSHCAR提供结构蛋白,制备表达红绿荧光蛋白报告基因的重组病毒颗粒,并验证其表达能力。同时,通过实验,比较单独pSCK-EGFP-IRES-dsRED质粒和所制备的含有红绿荧光蛋白报告基因的重组病毒颗粒的表达能力。通过调整共转染时复制子表达载体和辅助载体的比例,并计算病毒滴度,初步摸索甲病毒包装的优化实验条件。通过检测报告基因的表达情况初步可以看出重组病毒颗粒表达效率比单独转染pSCK-EGFP-IRES-dsRED质粒要高,所制备的重组病毒滴度能够达到6.5×105IU/mL。通过对比在共转染时复制子DNA表达载体和辅助载体的摩尔比为1:1或者是质量比为1:1,经过检测红绿荧光蛋白报告基因,得出的实验结果是:共转染时可复制型DNA表达载体和辅助载体的质量比为1:1时,能得到更高滴度的病毒颗粒。在上述研究基础上,进一步对本室前期构建的HBV复制子DNA疫苗pSCK-HBV-Fc-GPI-IRES-GM/B7进行病毒样颗粒化包装研究。将pSCK-HBV-Fc-GPI-IRES-GM/B7质粒与辅助载体共转染BHK21细胞,收集细胞培养上清,制备HBV复制子病毒颗粒疫苗,并通过流式细胞仪和免疫荧光检测HBV复制子病毒颗粒疫苗的表达能力。初步结果可以看出,HBV复制子病毒颗粒疫苗能够在细胞中表达,经病毒滴度测定,制备的重组病毒滴度达到1.5×105 IU /mL。然后,我们借鉴国外的最新研究,以基于SFV（塞姆利基森林病毒）的可复制型病毒颗粒疫苗为基础,对其进行DCs靶向化研究。主要工作就是对基于SFV的辅助载体pSHCAR进行DC靶向化改造,使其辅助包装的病毒颗粒能特异性地结合DC表面分子DC-SIGN,从而实现病毒颗粒疫苗对DC细胞的特异性感染,进一步提高抗原递呈效率。最后对改造后的辅助载体进行表达和包装能力的初步验证。初步结果证实:改造后的辅助载体pSHCART具有较好的表达能力,通过RT-PCR检测手段证明改造后的辅助载体具有包装并形成病毒的能力,并且通过与复制子表达载体共转染能提高复制子表达载体的表达率。为了进行重组甲病毒颗粒体外DC靶向化实验研究,本实验还构建了能够稳定表达DC-SIGN分子的BHK21细胞系。通过构建真核表达载体pIRES-neo-DC-SIGN,将重组质粒转染BHK21细胞,以G418进行阳性克隆的筛选,通过有限稀释法筛选出稳定表达DC-SIGN分子的BHK21细胞系,利用流式细胞仪、Western印迹及免疫荧光法检测DC-SIGN分子的表达,最终成功构建了能稳定表达人DC-SIGN分子的BHK21细胞系,为接下来DC靶向化重组甲病毒颗粒体外实验研究奠定了基础。该DC靶向可复制型甲病毒颗粒疫苗载体系统的最终研究成功,将在“颗粒化、内源化、高效化、靶向化”递呈抗原方面,具有不可比拟的技术优势。其应用价值和潜力,有待于进一步研究验证。