连续切换二维毛细管电泳分离系统的构建——接口和相关技术发展及其在蛋白质组研究中的应用

论文题目: 连续切换二维毛细管电泳分离系统的构建——接口和相关技术发展及其在蛋白质组研究中的应用

论文类型: 博士论文

论文专业: 分析化学

作者: 刘和春

导师: 张玉奎

关键词: 蛋白质组学,接口,二维毛细管电泳,分离平台

文献来源: 中国科学院研究生院（大连化学物理研究所）

发表年度: 2005

论文摘要: 对复杂蛋白质体系的分离分析已经超出了一维分离技术的能力。鉴于传统的蛋白质组分离技术2D-PAGE 存在的固有缺陷,发展新型快速、高通量、规模化的多维蛋白质分离分析技术已成为加快蛋白质组学研究的关键。多维立体分离中,接口技术是提高系统性能的瓶颈。本论文立足于发展新型高效多维毛细管电泳接口及相关技术,以分离复杂蛋白质样品为目标,构建连续切换的二维毛细管电泳蛋白质分离技术平台。　微透析中空纤维薄膜可以用作二维CE 接口。本文设计了一简便、快速、规格可随意调整的中空纤维薄膜制备装置,并成功制备出与分离柱管匹配、可作为二维毛细管电泳接口的中空纤维薄膜。基于2D-PAGE的分离原理,以这种中空纤维薄膜接口构建了毛细管等电聚焦-毛细管无胶筛分电泳二维(2D-CIEF-CNGSE)蛋白质分离平台,并用于对血红蛋白变体混合物和小鼠肺癌细胞分泌蛋白实际样品进行快速分离。2D-CIEF-CNGSE无论是分辨率、柱效还是峰容量都优越于各自一维的分离模式;与2D-PAGE相比,二维立体分离系统具有快速、高效等优点。2D-CE 对接口的要求很高,为了实现二维分离毛细管无额外死体积连接,设计并制作了柱上原位蚀刻的多孔膜接口,以此为核心构建了毛细管等电聚焦-毛细管区带电泳二维(2D-CIEF-CZE)蛋白质分离平台。零死体积接口保证了柱系统的高效分离性能、高分辨率、高峰容量,柱上原位多孔膜接口是不同模式毛细管分离柱连接技术的一大突破,可以将柱外死体积控制在极小的水平,尤其适合于基于毛细管电泳的二维及多维联用系统。CIEF 是2D-CE 中第一维分离的首选分离模式。经由第一维分离的样品进一步向第二维分离系统中的传输是一项非常关键的技术,直接影响到分离的总体效果。以蚀刻的多孔膜接口为核心,采用毛细管作为电渗柱设计了一种微型电渗泵(EOP),通过控制电压调节泵的输出流量,可便利地达到调节聚焦区带迁

论文目录:

第一章文献综述

1.1 引言

1.2 蛋白质组研究中的分离技术

1.2.1 二维聚丙烯酰胺凝胶电泳(2D-PAGE)

1.2.2 多维液相色谱/毛细管电泳

1.2.2.1 多维色谱分离的理论基础

1.2.2.2 二维高效液相色谱(2D-HPLC-HPLC)

1.2.2.2.1 2D-SEC-RPLC

1.2.2.2.2 2D-IEC-RPLC

1.2.2.2.3 多维蛋白质识别技术(MudPIT)

1.2.2.2.4 2D-AC-RPLC

1.2.2.3 高效液相色谱-毛细管电泳(HPLC-CE)

1.2.2.3.1 2D-RPLC-CE

1.2.2.3.2 2D-IMAC-CE

1.2.2.3.3 2D-CIEF-RPLC

1.2.2.4 二维毛细管电泳(2D-CE-CE)

1.2.2.5 芯片上的多维色谱/电泳分离模式

1.3 本论文的选题思想

参考文献

第二章二维毛细管电泳中微透析中空纤维膜接口的制作与应用

第一节聚砜微透析中空纤维薄膜的制备及膜接口的制作

2.1.1 引言

2.1.2 实验部分

2.1.2.1 试剂和材料

2.2.1.2 微透析中空纤维膜的制备方法

2.1.3 结果与讨论

第二节毛细管等电聚焦—毛细管无胶筛分电泳二维蛋白质分离平台的构建及应用

2.2.1 引言

2.2.2 实验部分

2.2.2.1 仪器

2.2.2.2 试剂和材料

2.2.2.3 实验过程

2.2.2.3.1 蛋白质样品溶液的配制

2.2.2.3.2 毛细管内壁改性处理

2.2.2.3.2.1 线性聚丙烯酰胺化学健合涂层

2.2.2.3.2.2 甲基纤维素物理吸附涂层

2.2.2.3.3 一维CIEF蛋白质分离

2.2.2.3.4 一维CNGSE蛋白质分离

2.2.2.3.5 中空纤维膜接口的设计、制作

2.2.2.3.6 2D-CIEF-CNGSE分离平台的构建

2.2.2.3.7 2D-CIEF-CNGSE蛋白质分离

2.2.3 结果与讨论

2.2.3.1 中空纤维膜接口的优化及其输运特征

2.2.3.2 一维CIEF 及CNGSE蛋白质分离条件的选择

2.2.3.3 2D-CIEF-CNGSE系统的输运动力

2.2.3.4 第二维CNGSE 的进样时间和CNGSE 分离时间

2.2.3.5 应用实例

2.2.3.5.1 血红蛋白的2D-CIEF-CNGSE 分离

2.2.3.5.2 小鼠肺癌细胞分泌蛋白2D-CIEF-CNGSE 分离

2.2.4 小结

参考文献

第三章二维分离平台中柱上原位多孔膜接口的制作与应用

第一节柱上原位多孔膜接口的制作和表征

3.1.1 前言

3.1.2 实验部分

3.1.2.1 仪器

3.1.2.2 材料和试剂

3.1.2.3 实验过程

3.1.2.3.1 接口池及柱上多孔玻璃膜接口的设计与制作

3.1.2.3.2 毛细管内壁预处理

3.1.3 结果与讨论

3.1.3.1 蚀刻多孔膜接口的表征

3.1.3.2 蚀刻多孔膜接口的性能考察

3.1.3.2.1 多孔膜离子的通透性

3.1.3.2.2 多孔膜接口内表面对蛋白的吸附性

3.1.4 小结

第二节毛细管等电聚焦-毛细管区带电泳二维分离平台的构建及应用

3.2.1 引言

3.2.2 实验部分

3.2.2.1 仪器

3.2.2.2 材料和试剂

3.2.2.3 实验过程

3.2.2.3.1 CIEF 样品溶液的配制

3.2.2.3.2 2D-CIEF-CZE 分离平台的构建

3.2.2.3.3 2D-CIEF-CZE 蛋白质分离

3.2.3 结果与讨论

3.2.3.1 多孔膜接口的性能和溶质的输运特征

3.2.3.2 2D-CIEF-CZE 系统的输运动力

3.2.3.3 第二维CZE 的进样长度和分离速度

3.2.3.4 2D-CIEF-CZE 的正交性和峰容量的估算

3.2.3.5 应用实例

3.2.4 小结

参考文献

第四章开管电渗泵的制作及其应用研究

第一节开管电渗泵的设计与制作

4.1.1 前言

4.1.2 实验部分

4.1.2.1 仪器

4.1.2.2 材料和试剂

4.1.2.3 电渗泵的结构与制作说明

4.1.2.4 实验方法

4.1.3 结果与讨论

4.1.3.1 电渗缓冲液浓度对输出压强的影响

4.1.3.2 电压对输出压强的影响

4.1.3.3 电渗载流缓冲液pH对输出压强的影响

4.1.3.4 电渗泵输液重复精度

4.1.4 小结

第二节开管电渗泵在毛细管等电聚焦中的应用

4.2.1 引言

4.2.2 实验部分

4.2.2.1 仪器

4.2.2.2 材料和试剂

4.2.2.3 实验过程

4.2.2.3.1 样品溶液的制备

4.2.2.3.1.1 CIEF 样品溶液的配制

4.2.2.3.1.2 鹿茸冻干粉可溶物样品的制备

4.2.2.3.2 实验装置及其操作说明

4.2.3 结果与讨论

4.2.3.1 等电聚焦条件的选择

4.2.3.2 电渗载流缓冲液的选择

4.2.3.3 区带迁移过程CIEF加电与断电谱峰展宽对比

4.2.3.4 电渗泵驱动与高差流体力驱动区带的对比

4.2.3.5 电渗泵在CIEF 的实际应用

4.2.3.5.1 标准蛋白质混合物的分离

4.2.3.5.2 鹿茸冻干粉可溶物样品的分离

4.2.4 小结

参考文献

第五章新型毛细管电泳-电喷雾质谱联用接口设计及应用

第一节无鞘流液CE

5.1.1 前言

5.1.2 实验部分

5.1.2.1 仪器

5.1.2.2 材料和试剂

5.1.2.3 实验方法

5.1.2.3.1 无鞘流液多孔膜接口制作

5.1.2.3.2 CE

5.1.2.3.3 CE

5.1.3 结果与讨论

5.1.3.1 鞘流液的影响

5.1.3.2 重现性

5.1.3.3 检出限

5.1.4 小结

第二节 CE/ESI-MS 无鞘流液多孔膜接口操作参数的系统考察

5.2.1 引言

5.2.2 实验部分

5.2.2.1 仪器

5.2.2.2 材料和试剂

5.2.2.3 实验方法和结果讨论

5.2.2.3.1 锥形喷雾端口无鞘流液多孔膜接口的制作

5.2.2.3.2 接口优化系统实验-电泳直接进样法

5.2.2.3.2.1 鞘流液对背景缓冲液响应信号的影响

5.2.2.3.2.2 毛细管末端与质谱入口间距对信号的影响

5.2.2.3.2.3 喷雾电压对质谱信号的影响

5.2.2.3.2.4 鞘流气流量对质谱信号的影响

5.2.2.3.3 接口优化系统实验-压力直接进样法

5.2.2.3.3.1 毛细管伸出ESI不锈钢针管距离的影响

5.2.2.3.3.2 喷雾电压对质谱信号的影响

5.2.3 小结

参考文献

论文工作总结

附录

作者简介及发表论文

致谢

发布时间: 2005-10-15

连续切换二维毛细管电泳分离系统的构建——接口和相关技术发展及其在蛋白质组研究中的应用

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