兔类胚胎干细胞体外培养体系的优化与建立

论文摘要

本研究以兔为材料,系统地研究了不同培养条件和传代方法对兔类ES、EG细胞分离培养的影响,为完善兔类ES、EG细胞建系的技术路线提供资料。实验主要结果如下:1试验比较不同饲养层和不同培养液对ES细胞分离培养的影响。选用DMEM+15%FBS+0.1mMβ-巯基乙醇+0.1mM MEM+100IU/ml青霉素+100IU/ml链霉素+1000IU/ml LIF+10mg/mL胰岛素作为体外分离培养家兔ES细胞的培养液,胚胎能较快贴壁、增殖,兔类ES细胞最高能够传至5代而不分化。无饲养层培养与在MEF、REF饲养层中培养的家兔胚胎贴壁率,ICM增殖率之间有极显著差异（P<0.05）,几乎不能传代。MEF作为饲养层,胚胎的贴壁率为67.4%,最高传代至第5代;以REF为饲养层胚胎的贴壁率为63.2%,最高传至第4代。2本试验对ICM和类ES细胞集落采用三种不同的传代方法进行传代,结果发现,连续消化法相对一次消化法ES细胞克隆的比率大为提高,连同饲养层一起消化产生ES克隆的比率太低,ES细胞只传1代,不适合用作ES细胞的早期分离、传代。3 14～18d胎龄的兔胎儿均能分离得到PGCs原代集落,但是15、16d的胎儿分离得到的集落数要比14、17、18d胎儿得到的集落要多,类EG细胞最高传了9代,适合克隆兔类EG细胞。SD大鼠心肌条件培养基能够较好地促进兔PGCs的分离培养,与添加LIF组差异不显著（P>0.05）,但明显好于未添加LIF组,可以用于兔PGCs的分离培养。4将取得的兔PGCs分别培养在MEF﹑REF饲养层上或与同源兔胎儿生殖脊成纤维细胞（HEFgr）﹑兔睾丸支持细胞（RSC）共培养。结果表明,采用共培养的模式分离得到的集落明显多于传统的饲养层模式。与RSCs共培养得到的EG细胞集落数最多,保持未分化的时间最长,并传了8代,与HEFgr共培养得到的EG细胞集落数与RSCs相比差异不明显,但最高只传了6代。培养在MEF上的兔类EG细胞也能较好的保持未分化状态,传了4代。培养在REF上的兔类EG集落数目较少,出现分化时间较早,只传了3代。因此可以用与RSCs或HEFgr共培养的方法分离培养兔PGCs。5试验比较了不同传代方法对兔类EG细胞传代的影响,结果发现手工传代和连同饲养层细胞一起消化传代法均获得了较高的P1集落数,两者差异不显著,但手工传代EG集落能够传至第9代,而连同饲养层细胞一起消化只能将EG细胞传至第4代,不适合作为兔类EG细胞传代的方法。6分离得到的兔ES、EG细胞,经形态学观察、AKP染色、体外分化能力检测实验等,证明其具有胚胎干细胞的诸多特性。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 文献综述
• 第一章 胚胎干细胞研究进展及应用前景
• 1.1 前言
• 1.2 干细胞概念，来源及分类
• 1.3 ES 细胞的生物学特征
• 1.3.1 形态特征
• 1.3.2 多能性
• 1.3.3 无限的自我更新能力
• 1.3.4 种系传递的能力
• 1.3.5 体外可操作性
• 1.4 胚胎干细胞研究历史
• 1.4.1 小鼠胚胎干细胞研究进展
• 1.4.2 灵长类和人类胚胎干细胞研究进展
• 1.4.3 兔胚胎干细胞研究进展
• 1.5 原始生殖细胞（PGC）研究进展
• 1.5.1 原始生殖细胞（PGCs）的发生、迁移和增殖
• 1.5.2 ES 细胞和EG 细胞的性状比较
• 1.5.3 原始生殖细胞的研究历史
• 1.6 胚胎干细胞自我更新和全能性维持的分子机制
• 1.6.1 白血病抑制因子及其介导的信号转导系统
• 1.6.2 Oct4 与ES 细胞的自我更新和全能性维持
• 1.6.3 nanog 基因在ES 细胞的自我更新和全能性维持中的作用
• 1.7 影响胚胎干细胞建系的因素
• 1.7.1 遗传因素
• 1.7.2 胚胎日龄
• 1.7.3 饲养层
• 1.7.4 培养基
• 1.7.5 添加物
• 1.7.6 ES 传代方法和消化液
• 1.8 胚胎干细胞的鉴定
• 1.9 胚胎干细胞的应用前景及存在的问题
• 1.9.1 发育生物学方面的应用
• 1.9.2 分子遗传学方面的应用前景
• 1.9.3 动物克隆和生产转基因动物
• 1.9.4 在临床医学方面的应用前景
• 1.9.5 在药学或化学评估中的作用
• 1.9.6 在家畜育种方面的应用前景
• 1.9.7 存在的问题
• 试验部分
• 第二章 家兔内细胞团来源胚胎干细胞的分离培养及传代
• 2.1 引言
• 2.2 实验材料
• 2.2.1 实验动物
• 2.2.2 主要试剂
• 2.2.3 主要仪器
• 2.2.4 主要溶液配制
• 2.2.5 ES 细胞培养液
• 2.3 试验方法
• 2.3.1 成纤维细胞的培养
• 2.3.2 成纤维细胞的冷冻
• 2.3.3 饲养层的制作
• 2.3.4 家兔胚胎的获取
• 2.3.5 兔胚胎的处理和培养
• 2.3.6 内细胞团的分离和类ES 细胞的传代
• 2.3.7 家兔类ES 细胞的鉴定
• 2.3.8 统计分析
• 2.4 试验结果
• 2.4.1 家兔胚胎的形态特征
• 2.4.2 胚胎的生长行为观察
• 2.4.3 不同培养液对家兔类ES 细胞分离培养的影响
• 2.4.4 不同传代方法对对家兔类ES 细胞传代的影响
• 2.4.5 鉴定
• 2.5 讨论
• 2.5.1 不同ES 细胞培养液对兔类ES 细胞分离培养的影响
• 2.5.2 不同饲养层对兔类ES 细胞分离培养的影响
• 2.5.3 不同传代方法对兔类ES 细胞传代的影响
• 第三章 从原始生殖细胞分离培养兔类ES 细胞
• 3.1 前言
• 3.2 试验材料
• 3.2.1 实验动物
• 3.2.2 主要仪器与试剂
• 3.3 试验方法
• 3.3.1 REF、MEF 饲养层的制备
• 3.3.2 家兔睾丸支持细胞（RSCs）的培养
• 3.3.3 同源兔胎儿生殖脊成纤维细胞（HEFgr）的分离与培养
• 3.3.4 大鼠心肌细胞条件培养液制备
• 3.3.5 原代PGCs 的收集、培养
• 3.3.6 PGCs 传代和类EG 细胞获取
• 3.3.7 结果鉴定
• 3.4 结果
• 3.4.1 原代PGCs 生长特征
• 3.4.2 家兔PGCs 传代后的生长行为
• 3.4.3 胎龄大小对兔PGCs 分离培养的影响
• 3.4.4 不同培养方式和饲养层对兔EG 细胞分离、克隆的影响
• 3.4.5 大鼠心肌条件培养基对兔EG 细胞培养的影响
• 3.4.6 不同传代方式对兔EG 细胞建系的影响
• 3.4.7 EG 细胞鉴定
• 3.5 讨论
• 3.5.1 胎龄大小对兔PGCs 分离培养的影响
• 3.5.2 不同培养方式和饲养层对兔EG 细胞分离、克隆的影响
• 3.5.3 大鼠心肌条件培养基对兔EG 细胞培养的影响
• 3.5.4 不同传代方式对兔EG 细胞建系的影响
• 结论
• 参考文献
• 附图
• 本论文常用英文缩写
• 致谢
• 个人简介