论文摘要
水稻是世界上最重要的粮食作物之一,提供了世界一半以上人口的主食需求。因此,提高水稻产量对应对新粮食危机具有很大意义。水稻粮食产量主要取决于水稻分蘖数目和穗型等关键因素。OsTB1能够增加水稻顶端优势,使分蘖芽的伸长受到明显的抑制。OsTB1带有碱性的螺旋-环-螺旋型DNA结合结构域,属于TCP家族转录因子。这一蛋白家族和植物的生长和发育有关,可能参与细胞周期基因的调控,进而调节植物的生长模式。本研究主要利用酵母双杂交的方法,筛选与OsTB1蛋白相互作用的蛋白。由于OsTB1属于TCP家族的转录因子,具有典型的TCP结构域和R结构域,有可能具有自身激活活性,因此PCR分别扩增了全长,N端-TCP-R、TCP-R及TCP-R-C端序列,分别连入pGBKT7表达载体上,构建了OsTB1全长、N端、M端及C端四个诱饵（Bait）,并转化至酵母菌株Y187中。将四个Bait与转入pGADT7空载体的AH109菌株进行小规模杂交,检测它们的转录激活活性,结果表明全长Bait在三缺（SD/-Trp/-Leu/-His）及四缺（SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade）平板上都有很强的自身激活活性；N端和C端Bait在三缺平板上具有自身激活活性,但在四缺平板上没有；M端Bait在三缺和四缺平板上都没有自身激活活性。对四个Bait进行Western blot检测,证明四个融合蛋白均可以在酵母菌内正常表达。用N端和C端Bait在四缺平板,M端Bait在三缺平板上分别筛选水稻分蘖芽cDNA文库,N端Bait筛库得到2000个左右的阳性克隆,C端Bait筛库得到67个阳性克隆；M端Bait筛库得到30个单克隆。在这2097个阳性克隆中,选取了15类感兴趣的insert)序列。将选取的阳性克隆大肠杆菌质粒重新转入AH109,分别与三个诱饵进行小规模的杂交验证。验证得到N1、N49、N78、N29、N167、N246、N343、N400、N112、N161、C30、M14共12种与诱饵蛋白互作的蛋白。将密码子优化后的OsTB1N端连入原核表达载体pMAL-c5X中,在大肠杆菌内诱导表达MBP-OsTB1N融合蛋白,并与直链淀粉树脂进行结合,融合蛋白能够与树脂特异性结合,这为酵母双杂交实验中筛选出的阳性克隆在体外进行MBP pull-down验证提供了必要条件。将12个Prey用体外转录翻译系统合成蛋白,与MBP-OsTB1N进行pull-down试验,目前已有N29与OsTB1的之间互作得到验证。为了研究OsTB1在水稻体内相互作用的蛋白及全基因组结合位点,构建了6个用于免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation,Co-IP）和染色质免疫沉淀（ChromatinImmunoprecipitation,ChIP）的植物表达载体。在这些载体中,OsTB1基因的N端或C端带有3xFLAG标签或含有2×IgG-BD、6×His及9×myc的TAPa标签（FLAG-OsTB1、OsTB1-FLAG、TAPa-OsTB1及OsTB1-TAPa）,这些标签便于用商业化的抗体进行IP和CHIP,并且还用OsTB1自身的启动子OsTB1 promoter或水稻组成型强肩动子actin1promoter驱动这些融合基因的转录。此外,为研究转录因子OsTB1的直接响应基因,构建了2个糖皮质激素（Glucocorticoid）诱导表达载体.分别用OsTB1 promoter和actin 1promoter驱动嵌合转录因子GVG的转录,当用糖皮质激素地塞米松（dexamethasone,DEX）诱导后,GVG蛋白进入细胞核内起始位于GVG识别序列下游的OsTB1转录,进而可以通过microarray的技术找出OsTB1的直接响应基因。通过农杆菌介导法,将上述几个载体转化水稻OsTB1基因的突变体SG0312的成熟胚性愈伤组织,在含潮霉素抗性的选择培养基上经两轮筛选和分化成苗,获得再生抗性植株。提取所获得转基因植株的基因组DNA,分别以潮霉素抗性基因引物和OsTB1基因引物进行PCR扩增,鉴定阳性植株,将转基因苗转移至大田种植,3个月后观察发现转基因植株pCAM-Op-OF的第13株系表型均得到了恢复,其余转基因植株也有一些植株表型得到了恢复。收获T1代的转基因种·子继续种植,为下一步研究OsTB1在水稻体内的相互作用蛋白、下游基因启动子区的DNA结合位点及其直接调节的下游基因提供了必要的前提条件。