催化水解亚氨基二乙腈生产亚氨基二乙酸菌株的诱变及发酵条件优化

论文摘要

亚氨基二乙酸是一种重要的精细化工中间体，其用途广泛，其中最主要的用途就是用于生产除草剂草甘膦。目前，亚氨基二乙酸法生产草甘膦是世界上主流的生产方法，因此其需求量将越来越大。而亚氨基二乙酸的生产都是采用化学法生产，包括：氢氰酸法、氯乙酸法、二乙醇胺法、亚氨基二乙腈水解法等主要合成工艺，但是这些方法一般都是污染严重、成本高、收率低。利用腈水解酶法生产亚氨基二乙酸具有反应条件温和、环境污染小、成本较低等优点。而酶法生产亚氨基二乙酸面临的主要问题是腈水解酶酶活不高，需通过菌种改良或构建基因工程菌的方法以得到具有较高腈水解酶酶活的菌株。本论文以生物合成产物亚氨基二乙酸为研究对象，详细探讨了产物的分离及表征，Alcaligenes faecalis ZJB09133菌株的诱变育种以及高产菌株的发酵条件优化。论文首先对亚氨基二乙腈的转化产物进行提取和表征。利用红外光谱、质谱、核磁共振等技术对目标化合物进行结构鉴定。根据检测结果显示，亚氨基二乙腈水解得到的产物确为亚氨基二乙酸。在亚氨基二乙酸转化液中加入2%的活性炭，在50℃下搅拌脱色1h,脱色率达到93.4%。当甲醇加入量是母液的2倍时，纯度达到最高的98.3%，收率也基本达到最大。当采用程序降温的方式结晶时，得到产品为晶体，晶体形状为单斜晶体。使用上述方法得到的重结晶样品纯度达到98.8%，收率为40.2%。以本实验室筛选并保藏的Alcaligenes faecalis ZJB09133为出发菌株，采用UV、UV-LiCl、等离子进行诱变处理，当紫外的照射时间和离子注入量分别为15s和60×2.3×1013ions/cm2时，正突变是最高，分别达到20%和22%。在挑取的所有菌落中，最终得到了3株腈水解酶酶活最高的菌株,且经过连续5代的传代培养，酶活没有明显的下降，其中UL144酶活是最高的，达到58.8U/g DCW，比初始菌株酶活提高了77.1%。对诱变后的高产菌株Alcaligenes faecalis UL144以单因素法进行培养条件的优化。确定最适的培养基成分为（g/L）：乙酸胺6，酵母膏4，K2HPO45，Al2（SO4）30.1，NaCl1，诱导剂正丁腈的加入量为0.6%。得到最佳的培养条件为：培养基的初始pH为8.5，装液量为80ml/500ml摇瓶，接种量为8%，在上述条件下培养，培养34h后，其生物量达到1.44g/L，腈水酶酶活达到69.49U/g DCW。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 亚氨基二乙酸
• 1.1.1 亚氨基二乙酸的物化性质
• 1.1.2 亚氨基二乙酸的应用
• 1.1.2.1 合成草甘膦
• 1.1.2.2 用作螯合剂
• 1.1.2.3 制备氮川三乙酸
• 1.1.2.4 其他应用
• 1.1.3 亚氨基二乙酸的化学合成方法
• 1.1.3.1 氢氰酸法
• 1.1.3.2 氨代氯乙酸法
• 1.1.3.3 氯乙酸-氨基乙酸法
• 1.1.3.4 氯乙酸钠肼化法
• 1.1.3.5 氮川三乙酸法
• 1.1.3.6 羟基乙腈法
• 1.1.3.7 二乙醇胺脱氢氧化法
• 1.1.3.8 亚氨基二乙腈水解合成亚氨基二乙酸
• 1.1.4 亚氨基二乙酸的生物合成方法
• 1.1.5 亚氨基二乙酸的分离方法
• 1.1.5.1 离子交换法
• 1.1.5.2 化学结晶法
• 1.1.5.3 电渗析法
• 1.1.6 亚氨基二乙酸的分析方法
• 1.1.6.1 化学滴定法
• 1.1.6.2 紫外分光光度法
• 1.1.6.3 色谱法
• 1.2 菌种的选育
• 1.2.1 自然选育
• 1.2.2 诱变选育
• 1.2.3 原生质体融合技术
• 1.2.4 基因工程改良方法
• 1.3 离子注入技术的应用研究
• 1.3.1 离子注入诱变作用机理
• 1.3.2 离子注入诱变微生物育种的方法
• 1.3.3 离子诱变育种的研究和应用
• 1.4 本论文研究内容及目标
• 参考文献
• 第二章 转化产物的分离纯化与结构鉴定
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 材料
• 2.2.1.1 菌株
• 2.2.1.2 培养基
• 2.2.1.3 主要试剂和器材
• 2.2.2 方法
• 2.2.2.1 亚氨基二乙腈生物转化
• 2.2.2.2 脱色和脱色率的计算
• 2.2.2.3 亚氨基二乙酸的纯度的测定
• 2.2.2.4 结晶产物结构鉴定
• 2.2.2.5 具体步骤
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 亚氨基二乙酸转化液脱色
• 2.3.2 甲醇加入量对收率和纯度的影响
• 2.3.3 冷却方式对晶型的影响
• 2.3.4 重结晶
• 2.3.5 亚氨基二乙酸的高效液相分析
• 2.3.6 红外光谱
• 2.3.7 核磁共振
• 2.3.8 质谱
• 2.4 本章小结
• 参考文献
• 第三章 催化水解亚氨基二乙腈生产亚氨基二乙酸菌株的诱变育种
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 材料
• 3.2.1.1 菌株
• 3.2.1.2 培养基
• 3.2.1.3 主要试剂和设备
• 3.2.2 方法
• 3.2.2.1 培养方法
• 3.2.2.2 菌体生长曲线的测定
• 3.2.2.3 紫外-氯化锂复合诱变
• 3.2.2.4 低能离子束诱变
• 3.2.2.5 突变率的计算
• 3.2.2.6 诱变菌株筛选
• 3.2.2.7 遗传稳定性的测定
• 3.2.2.8 菌体的收集
• 3.2.2.9 细胞转化
• 3.2.2.10 酶活定义
• 3.2.2.11 分析方法
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 菌体生长曲线的绘制
• 3.3.2 紫外-氯化锂复合诱变
• 3.3.3 低能离子束诱变
• 3.3.3.1 注入剂量与菌落存活数关系
• 3.3.3.2 各注入剂量的正负突变率
• 3.3.4 遗传稳定性的研究
• 3.3.5 腈水解酶高产菌诱变谱系
• 3.4 本章小结
• 参考文献
• 第四章 高产菌株UL144 培养条件优化
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 材料
• 4.2.1.1 菌株
• 4.2.1.2 培养基
• 4.2.1.3 主要试剂和设备
• 4.2.2 方法
• 4.2.2.1 培养方法
• 4.2.2.2 菌体的收集
• 4.2.2.3 细胞转化
• 4.2.2.4 酶活定义
• 4.2.2.5 分析方法
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 碳源的筛选
• 4.3.2 乙酸铵浓度的影响
• 4.3.3 氮源的筛选
• 4.3.4 酵母膏的用量的优化
• 4.3.5 金属离子的选择
• 4.3.6 Al3+的用量的优化
• 4.3.7 诱导剂的选择
• 4.3.8 正丁腈用量的优化
• 4.3.9 培养基的初始pH对菌体生长及产酶的影响
• 4.3.10 接种量对菌体生长及产酶的影响
• 4.3.11 装液量对菌体生长及产酶的影响
• 4.3.12 菌体的生长及产酶的曲线
• 4.4 本章小结
• 参考文献
• 第五章 结论与展望
• 5.1 结论
• 5.2 展望
• 攻读硕士学位期间发表的主要学术论文
• 致谢