家蚕BmycaCR基因的原核表达和亚细胞定位研究

论文摘要

YcaCR蛋白含有一个保守的ycaC-related结构域,属于异分支酸酶超家族,据推测其功能可能与异分枝酸酶类似,但是具体底物和生物学功能尚不清楚。从本实验室构建的家蚕蛹cDNA文库中检索到一个EST序列,该序列编码一个含有ycaC-related保守结构域的蛋白的一个片断,进而得到该cDNA的全长序列。该序列被命名为BmycaCR,GenBank登录号为GU292794。预测该基因编码的蛋白分子量为22.838 kD。我们将其完整ORF序列克隆到原核表达载体pET-28a（+）中,构建的重组质粒经PCR及双酶切鉴定成功后,转化到E. coli Rosetta（DE3）中,经IPTG诱导成功表达了融合蛋白His-BmycaCR。超声破碎后发现该蛋白以可溶的形式存在于上清中,经亲和层析纯化后,得到较纯的融合蛋白His-BmycaCR。将纯化后的His-BmycaCR为抗原免疫新西兰大白兔后制备该蛋白的多克隆抗体,经ELISA检测,抗体效价可达1:6400以上。我们还采用荧光定量PCR和Western blot的方法,对BmycaCR在家蚕卵、五龄幼虫、蛹、蛾四个发育时期以及五龄幼虫各组织中的转录水平和表达情况进行分析,结果显示:在各发育时期中,BmycaCR基因在卵时期的转录水平和表达量最高,而在蛾时期的转录水平和表达量最低,在家蚕五龄幼虫各组织中,BmycaCR基因的转录水平由高到低依次为睾丸、气管、脂肪体、卵巢、表皮、肠、血、马氏管、丝腺、头部;在五龄幼虫的各组织中,该蛋白在睾丸、马氏管、气管、卵巢、表皮、肠和脂肪体中均有表达,而在头部、血和丝腺中未检测到阳性信号。亚细胞定位结果表明,BmycaCR蛋白在家蚕BmN细胞的细胞核和细胞质中均有分布,但在靠近质膜区域检测到较强的荧光信号。研究结果为以后研究该蛋白的功能特性奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略语
• 第一章 文献综述
• 引言
• 1 异分支酸酶（Isochorismatase）超家族
• 1.1 烟酰胺酶家族
• 1.2 烟酰胺酶相关的氨基水解酶家族
• 1.3 氨甲酰肌氨酸酰胺水解酶家族
• 1.4 异分支酸酶家族
• 1.5 ycaC 相关基因产物家族
• 2 ycaC 及其相关蛋白
• 2.1 ycaC 蛋白
• 2.2 ycaCR 蛋白
• 2.3 ycaCR 蛋白的进化树
• 3 展望
• 第二章 实验设计方案
• 1 实验目的和意义
• 2 研究内容
• 3 实验流程图
• 第三章 生物信息学分析
• 1 生物信息学分析工具
• 2 分析流程及结果
• 2.1 BmycaCR 基因基本信息
• 2.2 BmycaCR 蛋白疏水性分析
• 2.3 BmycaCR 蛋白信号肽预测
• 2.4 BmycaCR 蛋白跨膜区分析
• 2.5 BmycaCR 蛋白定位预测
• 2.6 BmycaCR 蛋白功能位点的预测
• 2.7 BmycaCR 蛋白二级结构的预测
• 2.8 BmycaCR 蛋白高级结构的预测
• 3 讨论
• 第四章 家蚕BmycaCR 基因的原核表达
• 1 材料与试剂
• 1.1 材料
• 1.2 订购试剂
• 1.3 主要试剂的配制
• 2 方法
• 2.1 PCR 扩增目的片段
• 2.2 凝胶回收、纯化PCR 产物
• 2.3 目的片段与pET-28a（+）载体双酶切与回收
• 2.4 连接反应
• 2 法制备E.coli TG1 感受态细胞'>2.5 CaC1₂ 法制备E.coli TG1 感受态细胞
• 2.6 连接产物的转化
• 2.7 重组质粒pET-28a（+）-BmycaCR 的筛选与鉴定
• 2.7.1 挑斑与质粒抽提
• 2.7.2 PCR 鉴定
• 2.7.3 双酶切鉴定
• 2.8 BmycaCR 基因的表达
• 2 法制备E.coli Rosetta 感受态细胞'>2.8.1 CaC1₂ 法制备E.coli Rosetta 感受态细胞
• 2.8.2 重组质粒pET-28a（+）-BmycaCR 的筛选与鉴定
• 2.8.3 His-融合蛋白在大肠杆菌中的表达
• 2.8.4 蛋白凝胶电泳检测
• 3 结果
• 3.1 PCR 扩增目的基因
• 3.2 重组质粒pET-28a（+）-BmycaCR 的鉴定
• 3.3 His 融合蛋白的表达
• 4 讨论
• 第五章 融合蛋白的纯化及抗体制备
• 1. 材料与试剂
• 1.1 材料
• 1.2 订购试剂
• 1.3 主要试剂的配置
• 2. 方法
• 2.1 融合蛋白的纯化
• 2.1.1 融合蛋白的大量表达与样品制备
• 2.1.2 Ni-NTA 柱纯化融合蛋白
• 2.1.3 Bradford 法检测蛋白浓度
• 2.2 多克隆抗体的制备
• 2.2.1 抗原的制备
• 2.2.2 免疫新西兰兔
• 2.2.3 多克隆抗血清的制备
• 2.3 间接ELISA 法测定抗体效价
• 2.4 抗体特异性检测
• 3 结果
• 3.1 融合蛋白的纯化
• 3.2 质谱分析
• 3.3 间接ELISA 法测定抗体效价
• 3.4 Western blot 检测抗体的特异性
• 4 讨论
• 第六章 BmycaCR 蛋白的表达分析
• 1 材料与试剂
• 1.1 材料
• 1.2 试剂
• 1.3 主要试剂的配制
• 2 方法
• 2.1 总RNA 的提取
• 2.2 DNA 酶消化
• 2.3 cDNA 第一链的合成
• 2.4 荧光定量PCR
• 2.4.1 荧光定量PCR 引物的设计
• 2.4.2 荧光定量PCR 反应体系
• 2.4.3 荧光定量PCR 数据分析
• 2.5 家蚕五龄幼虫不同组织总蛋白的提取
• 2.6 Western blot 检测BmycaCR 蛋白的分布
• 3 结果
• 3.1 家蚕发育过程中BmycaCR mRNA 转录水平分析
• 3.2 家蚕五龄幼虫各组织中BmycaCR mRNA 转录水平分析
• 3.3 家蚕不同发育时期BmycaCR 蛋白表达量的比较
• 3.4 家蚕五龄幼虫各组织中BmycaCR 蛋白表达量的比较
• 4 讨论
• 第七章 亚细胞定位
• 1 材料与试剂
• 1.1 材料
• 1.2 试剂
• 1.3 试剂配制
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 结论
• 参考文献
• 致谢