牛蒡子苷提取、纯化及其对小鼠C2C12细胞生长的影响

论文摘要

牛蒡子为菊科（Compositae）牛蒡属（Arctium）植物牛蒡（Arctium lappa Linne）干燥成熟果实,在我国有着广泛的分布和悠久的药用历史,其中的牛蒡子苷是一种具有多种生理活性的物质。本课题以牛蒡子作为研究对象,对其有效成分牛蒡子苷进行提取和纯化,并对其生理活性进行了初步研究,为牛蒡子中木脂素成分牛蒡子苷的进一步开发利用奠定了基础。首先,确定了牛蒡子中牛蒡子苷的提取方案。以牛蒡子苷标准品为对照,利用高效液相色谱法定量测定牛蒡子苷,以牛蒡子苷的得率为指标,采用正交试验对提取的工艺参数进行优化,最后确定牛蒡子苷的提取方案是：乙醇浓度70%（V/V）,料液比1：8（W/V）,提取时间1h,回流次数3次。其次,利用大孔吸附树脂、硅胶柱层析法对牛蒡子中牛蒡子苷的乙醇提取物进行纯化,以牛蒡子苷标准品为对照,利用高效液相色谱法定量测定牛蒡子苷,最终得到牛蒡子苷纯化物（≥80%）。同时,确定了牛蒡子苷粗品纯化工艺。对6种大孔吸附树脂进行筛选,确定最佳树脂为D4006型大孔树脂；并对最佳树脂吸附-洗脱牛蒡子苷粗提液的工艺进行了实验研究,确定了分离富集工艺为：上样流速控制为1BV/h,柱径高比控制为1：5；经水洗除去糖和蛋白质后,再换以4BV 50%乙醇洗脱,收集50%醇洗液。经硅胶柱层析纯化后,浓缩干燥即得纯度大于80%的牛蒡子苷。最后,对牛蒡子苷的促生长作用进行了初步研究。以体外培养的C2C12成肌细胞和经2%马血清诱导分化的肌细胞为研究对象,采用四唑盐（MTT）比色法检测C2C12成肌细胞增殖能力,以诱导分化后的肌细胞内蛋白含量和磷酸肌酸激酶含量变化为指标观察大豆黄酮和牛蒡子苷对分化后的肌细胞生长的影响,采用real-time PCR分析C2C12细胞中ERβmRNA表达量。结果表明牛蒡子苷终浓度达到10ng/ml、大豆黄酮终浓度为10ng/ml时均能极显著促进C2C12成肌细胞增殖（P<0.01）,促进肌细胞总蛋白质的合成（P<0.01）,促进肌细胞肌酸激酶的活性（P<0.01）,促进肌细胞中ERβmRNA表达量极显著上升。所以,植物提取物牛蒡子苷可提高C2C12成肌细胞的增殖和分化后的肌细胞肥大,进而促进骨骼肌细胞肥大型生长。这种促生长作用是通过直接作用于肌细胞上的ERβ介导的。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 本文常用缩略语
• 引言
• 文献综述
• 1 牛蒡子概述
• 1.1 牛蒡子来源及分布
• 1.2 牛蒡子的药用历史
• 1.3 牛蒡子的化学成分
• 2 牛蒡子苷的提取和代谢
• 2.1 牛蒡子苷的组成、结构及其含量
• 2.2 牛蒡子苷对机体的作用
• 3 牛蒡子苷的生理活性
• 3.1 抗癌作用
• 3.2 对免疫系统的调节作用
• 3.3 降血糖的作用
• 3.4 雌激素样和抗雌激素样活性
• 3.5 对白血病的抑制作用
• 3.6 其他作用
• 4 牛蒡子苷的应用
• 4.1 在食品工业中的应用
• 4.2 在临床医学中的应用
• 4.3 在化妆品中的应用
• 4.4 在饲料工业中的应用
• 第一章 牛蒡子苷木脂素的提取工艺研究
• 1 材料与方法
• 1.1 材料与试剂
• 1.2 仪器与设备
• 1.3 牛蒡子苷木脂素的含量测定
• 1.4 正交试验设计
• 2 结果与分析
• 2.1 牛蒡子苷木脂素的含量测定
• 2.2 正交试验结果分析
• 3 讨论
• 4 小结
• 第二章 牛蒡子苷粗品的纯化工艺研究
• 1 材料与方法
• 1.1 材料与试剂
• 1.2 仪器与设备
• 1.3 牛蒡子苷木脂素的含量测定
• 1.4 大孔吸附树脂精制牛蒡子苷工艺参数优化
• 1.5 硅胶柱层析法纯化牛蒡子苷
• 2 结果与分析
• 2.1 六种大孔吸附树脂对牛蒡子苷的静态吸附-洗脱实验
• 2.2 D4006型大孔吸附树脂对牛蒡子苷的动态吸附试验
• 2.3 D4006型大孔树脂对牛蒡子苷的动态洗脱试验
• 2.4 硅胶柱层析法纯化牛蒡子苷
• 3 讨论
• 4 小结
• 第三章 牛蒡子苷对小鼠C2C12细胞生长的促进作用及机制初步探讨
• 1 材料与方法
• 1.1 材料与试剂
• 1.2 仪器与设备
• 1.3 C2C12细胞的培养和分化
• 1.4 MTT比色法检测细胞增殖
• 1.5 考马斯亮蓝法检测骨骼肌细胞总蛋白
• 1.6 肌酸激酶（CK）的测定
• 1.7 总RNA的提取（Trizol法）
• 1.8 反转录
• 1.9 实时荧光定量PCR
• 1.10 标准曲线的制作
• 1.11 统计分析
• 2 结果与分析
• 2.1 C2C12细胞培养
• 2.2 牛蒡子苷和大豆黄酮对未分化小鼠C2C12细胞增殖的影响
• 2.3 牛蒡子苷和大豆黄酮对分化后小鼠C2C12细胞总蛋白合成的影响
• 2.4 牛蒡子苷和大豆黄酮对分化后小鼠C2C12细胞肌酸激酶的影响
• 2.5 牛蒡子苷和大豆黄酮对分化后小鼠C2C12细胞中ER-β mRNA表达量的影响
• 3 讨论
• 4 结论
• 参考文献
• 全文结论
• 附录一
• 附录二
• 致谢