AtCBF3基因和ThNHX1基因的克隆和无选择标记植物表达载体的构建

论文摘要

农业生产中,植物的生长发育多受到各种环境因子的胁迫，诸如低温、干旱、盐碱等已成为主要的逆境胁迫因子，这些因素很大程度影响着农业的发展。CBF3（CRT/DRE-bindingfactor）蛋白就是这一类能调节低温相关基因的十分重要的转录激活因子。CBF3基因是在拟南芥中克隆并鉴定的转录激活因子，特异结合在DNA顺式调控元件DRE上，DRE包含COR基因簇，通过CBF3的不断超量表达来诱导COR基因表达。逆境诱导型启动子Rd29A是能够受到环境中干旱、低温、高盐等因素的诱导后使下游目的基因进行大量表达的基因,构建逆境诱导型启动子驱动调控的目的基因植物表达载体，对于目的基因在植物中高效与实用的选择性表达有重要的意义。CBF3基因和Rd29A基因能在干旱、低温及高盐胁迫条件下调控COR基因表达，并在上述逆境胁迫信号传递中起重要作用。当今对植物抗逆境中耐盐抗性的研究，大多集中于非耐盐植物中耐盐基因的研究，所以进展较慢。根据更深入的研究表明，在盐生植物中，有一种叫盐芥的耐盐植物较为适合耐盐性方面的研究。盐芥与拟南芥同为十字花科，其性质都具有以下相同特点：遗传特性、生活特性相似，具有植株较矮小、生长周期较短、种子数量多、自花传授粉、基因组较小、方便转化等特点。可以进一步发展盐芥作为一种新的模式植物系统进行相关性研究。转基因植物中的除草剂或抗生素抗性标记基因的生态环境和食用安全性一直颇有争议，选择标记基因的存在严重地阻碍了转基因植物的商品化进程和转化技术本身的有效性，无选择标记策略提供了解决抗生素或除草剂等标记基因所引起疑虑的一种新思路。由此可见，怎样培育无选择标记转基因作物已成为近年来植物基因工程研究的重点之一。本试验以拟南芥为研究材料，对其冷诱导相关的基因CBF3和逆境诱导型启动子Rd29A进行研究，以盐芥为研究材料，对其Na+/H+逆向转运蛋白结果如下：1.根据拟南芥的序列设计引物，通过PCR方法从植物拟南芥中克隆出冷诱导相关的基因CBF3和逆境诱导型启动子Rd29A。克隆的CBF3基因长750bp，编码216个氨基酸，与GeneBank公布的的序列相比对，核苷酸同源性达到100%，并利用生物信息学手段对其氨基酸序列、进化树等进行分析；启动子Rd29A全长为1425bp，与已报道的该启动子序列比较，其核苷酸同源性为100%。2.采用常规分子克隆技术，利用PMD18-T载体，成功地将CBF3基因和Rd29A启动子构建到双元植物表达载体pCAMBIA1301中，成功构建pCAMBIA1301-Rd29A-CBF3并通过冻融法将该重组质粒成功地导入根癌农杆菌菌株LBA4404中。3.根据盐芥的序列设计引物，通过RT-PCR方法从植物盐芥中克隆出相关耐盐基因ThNHX1。克隆的ThNHX1基因长1761bp，运用NCBI的ORFFinder查询软件得出最长编码区1635bp，编码545个氨基酸，与已知的拟南芥的Na+/H+逆向转运蛋白（GenBank登记号：NM122597）具有94.4%的相似性，和其他植物的Na+/H+逆向转运蛋白也有比较高的相似性。4.采用常规分子克隆技术，成功的剔除双元植物表达载体pCAMBIA1301中的筛选标记基因，并成功剔除其中的潮霉素筛选标记基因，构建了无筛选标记基因的植物表达载体pCAMBIA1301-NOhyg。并利用已克隆好的PMD18T-CBF3与PMD18T-ThNHX1酶切连接，构建共转化表达载体pCAMBIA1301-NOhyg-CBF3与pCAMBIA1301-NOhyg-ThNHX1，正转化农杆菌LBA4404转化烟草，以期获得转基因植株。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 目录
• 1 文献综述
• 1.1 植物基因启动子研究进展
• 1.1.1 启动子结构和功能
• 1.1.2 组成型启动子
• 1.1.3 组织或器官特异性启动子
• 1.1.4 诱导型启动子
• 1.1.4.1 化学因素诱导表达的启动子
• 1.1.4.2 生物因素诱导表达的启动子
• 1.1.4.3 物理因素诱导表达的启动子
• 1.1.5 R d29A 功能
• 1.1.5.1 胁迫基因功能
• 1.1.5.2 胁迫诱导基因的调控与表达
• 1.2 植物低温信号转录因子研究进展
• 1.2.1 植物转录因子的结构和功能
• 1.2.2 转录因子作用的分子机理
• 1.2.3 低温胁迫下 CBF 基因的表达与调控
• 1.2.3.1 CBF 基因及其作用
• 1.2.3.2 CBF 基因的表达
• 1.3 植物遗传转化中的剔除标记基因的研究
• 1.3.1 植物基因转化中常用的标记基因
• 1.3.2 去除选择标记基因的必要性
• 1.3.2.1 标记基因妨碍细胞多次重复转化
• 1.3.2.2 标记基因的安全性问题
• +/H⁺逆向转运蛋白基因研究进展'>1.4 耐盐基因 Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因研究进展
• +的吸收与转运'>1.4.1 盐胁迫下 Na⁺的吸收与转运
• +的吸收'>1.4.1.1 Na⁺的吸收
• +的外排'>1.4.1.2 Na⁺的外排
• +的区隔化'>1.4.1.3 Na⁺的区隔化
• +/H⁺逆向转运蛋白'>1.4.2 Na⁺/H⁺逆向转运蛋白
• +/H⁺逆向转运蛋白'>1.4.2.1 质膜中的 Na⁺/H⁺逆向转运蛋白
• +/H⁺逆向转运蛋白克隆'>1.4.2.2 液泡膜 Na⁺/H⁺逆向转运蛋白克隆
• +/H⁺逆向转运蛋白特征与功能'>1.4.2.3 液泡膜 Na⁺/H⁺逆向转运蛋白特征与功能
• +/H⁺逆向转运蛋白与植物耐盐性'>1.4.3 Na⁺/H⁺逆向转运蛋白与植物耐盐性
• 2 诱导表达的 AtCBF3 基因植物表达载体的构建
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 质粒和菌种
• 2.1.3 酶及化学试剂
• 2.1.4 主要仪器设备
• 2.1.5 培养基
• 2.1.6 溶液配制
• 2.1.7 引物合成
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 植物材料处理
• 2.2.2 基本分子生物学实验技术
• 2.2.2.1 拟南芥基因组 DNA 的提取
• 2.2.2.2 PCR 扩增
• 2.2.2.3 大肠杆菌 DH5a 感受态细胞的制备
• 2.2.2.4 大肠杆菌转化及蓝白斑筛选方法
• 2.2.2.5 转化子的进一步扩增和鉴定
• 2.2.2.6 PCR 产物的分离纯化
• 2.2.2.7 T/A 克隆回收片段与 T－载体的连接
• 2.2.2.8 酶切反应体系与 DNA 片段连接反应体系
• 2.2.3 拟南芥 CBF3 基因和 Rd29A 启动子的扩增
• 2.2.4 植物表达载体的构建：
• 2.2.4.1 拟南芥 CBF3 基因和 Rd29A 启动子的扩增
• 2.2.5 植物表达载体的农杆菌转化、农杆菌质粒的提取与鉴定
• 2.3 试验结果与分析
• 2.3.1 CBF3 基因的克隆以及重组质粒的鉴定
• 2.3.2 CBF3 的生物信息学分析
• 2.3.2.1 氨基酸序列比对及进化树分析
• 2.3.3 Rd29A 启动子的克隆
• 2.3.4 植物表达载体 pCAMBIA1301-Rd29A-CBF3 的构建与鉴定
• 2.4 讨论
• 2.5 结论
• 3 诱导表达的 AtCBF3 基因无选择标记植物表达载体的构建
• 3.1 试验材料
• 3.1.1 植物材料
• 3.1.2 质粒及菌种
• 3.1.3 酶及化学试剂
• 3.1.4 主要仪器设备
• 3.1.5 培养基
• 3.1.6 溶液配制
• 3.1.7 引物合成
• 3.2 试验方法
• 3.2.1 植物材料处理
• 3.2.2 基本分子生物学实验技术
• 3.2.2.1 拟南芥基因组 DNA 的提取
• 3.2.2.2 PCR 扩增
• 3.2.2.3 用 CaC l2制备大肠杆菌感受态细胞
• 3.2.2.4 大肠杆菌转化及蓝白斑筛选方法
• 3.2.2.5 转化子的进一步扩增和鉴定
• 3.2.2.6 PCR 产物的分离纯化
• 3.2.2.7 T/A 克隆回收片段与 T－载体的连接
• 3.2.2.8 pCAMBIA1301 质粒载体酶切反应体系
• 3.2.2.9 pCAMBIA1301 质粒载体酶切后片段的末端平滑反应体系
• 3.3 试验结果与分析
• 3.3.1 pCAMBIA1301 去除潮霉素重组质粒的构建与鉴定
• 3.3.2 无选择标记植物表达载体 pCAMBIA1301-NOhyg-CBF3 的构建与鉴定
• 3.4 讨论
• 3.4.1 无选择标记载体的构建
• 3.4.2 农杆菌共转化方法在植物转基因工程中的运用
• 3.5 结论
• 4 T hNHX1 基因无选择标记植物表达载体的构建
• 4.1 试验材料
• 4.1.1 植物材料
• 4.1.2 质粒及菌种
• 4.1.3 酶及化学试剂
• 4.1.4 主要仪器设备
• 4.1.5 培养基
• 4.1.6 溶液配制
• 4.1.7 引物合成
• 4.2 试验方法
• 4.2.1 植物材料处理
• 4.2.2 基本分子生物学实验技术
• 4.2.2.1 盐芥基因组 RNA 的提取
• 4.2.2.2 反转录
• 4.2.2.3 PCR 扩增
• 4.2.2.4 用 CaCl2制备大肠杆菌感受态细胞
• 4.2.2.5 大肠杆菌转化及蓝白斑筛选方法
• 4.2.2.6 转化子的进一步扩增和鉴定
• 4.2.2.7 PCR 产物的分离纯化
• 4.2.2.8 T/A 克隆回收片段与T-载体的连接
• 4.2.2.9 pCAMBIA1301-NOhyg 质粒载体酶切反应体系
• 4.3 试验结果与分析
• 4.3.1 盐芥 ThNHX1 基因的扩增
• 4.3.2 盐芥 ThNHX1 克隆和重组质粒的鉴定
• 4.3.3 ThNHX1 基因的氨基酸序列比对及进化树分析
• 4.3.4 ThNHX1 基因植物表达载体的构建与鉴定
• 4.4 讨论
• 4.5 结论
• 缩略词
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介
• [附]发表论文