萝卜镉胁迫响应的蛋白质组学研究

论文摘要

萝卜（Raphanus sativus L）为起源于我国的一种重要的根菜类蔬菜作物。重金属是蔬菜生产中最隐蔽、最难控制的污染源之一,镉（Cd）是生物毒性极强的重金属之一,过量的镉进入环境参与水体-土壤-生物系统循环,并通过食物链而被动物和人体摄入,严重威胁人体健康。随着环境污染问题的日益突出,镉污染已严重影响萝卜的安全生产。目前,植物对镉胁迫的响应机理已成为国内外学者研究的重要课题。蛋白质组学在后基因组时代发挥着越来越重要的作用。双向电泳（2-DE）技术作为蛋白质组学的支撑之一,被应用于生物学研究的许多领域。目前在蛋白质水平上阐述萝卜对镉胁迫响应机理的研究还非常少。本研究以萝卜高代自交系’NAU-RG’为材料,首先对萝卜蛋白质提取方法进行筛选优化、建立起萝卜蛋白质提取体系,为萝卜蛋白质组学的深入开展奠定了基础,利用双向电泳技术研究了萝卜叶片和根组织在不同浓度的镉胁迫下的蛋白质差异表达情况,并对根组织中差异非常显著的点进行了质谱鉴定与功能分析,利用半定量RT-PCR技术,对部分镉胁迫响应基因进行了克隆与转录水平的表达分析,为揭示萝卜镉胁迫响应机理提供了理论依据。主要研究结果如下：将5种在植物蛋白质提取中常用的方法应用于萝卜叶片的蛋白质提取,并进行适当优化,建立了萝卜叶片与根组织的蛋白质提取技术体系：叶片蛋白质提取方法为Tris-HCl/TCA-丙酮法；利用正交实验方法对根组织蛋白质提取方法—改良的酚提取法进行了优化。利用营养液水培的方式对萝卜幼苗进行重金属镉处理,处理浓度为0mg·L-1CdCl2.2.5H2O,50mg·L-1CdCl2·2.5H2O,100mg·L-1CdCl2·2.5H2O。获取实验材料,利用双向电泳技术分析镉胁迫条件下萝卜叶片的蛋白质组的响应情况,在萝卜叶片中共检测到10个差异表达的蛋白质点,其中有1个被Cd胁迫条件诱导表达,2个上调表达,5个下调表达,1个消失,1个在低浓度处理时下调,高浓度时上调。在萝卜根组织中共检测到31个差异表达的蛋白质点,经MALDI-TOF/TOF成功鉴定23个蛋白点,经数据库检索表明,细胞防卫相关蛋白占差异表达的蛋白质的56.5%,细胞代谢相关蛋白占30.4%,信号转导相关蛋白占8.7%。根据质谱鉴定结果,选择3个已知功能的差异蛋白质——蛋白质二硫化异构酶（Protein disulfide isomerase）、磷酸甘油酸酯激酶（Phosphoglycerate kinase）、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase）,利用半定量RT-PCR对编码这三个蛋白的基因（RsPDI, RsPGK, RsSOD）进行转录水平的表达分析,发现镉胁迫后,这三个基因在转录水平都发生了上调表达。对RsSOD基因进行了克隆,得到cDNA全长与完整的开放阅读框（ORF）。

论文目录

• 目录
• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词表
• 引言
• 第一部分 文献综述
• 1 镉的化学性质
• 2 镉对植物的胁迫效应
• 2.1 镉胁迫对生理功能的破坏
• 2.2 镉对生长发育的影响
• 3 植物对镉胁迫的响应机制
• 3.1 酶系统对镉胁迫的反应
• 3.2 镉胁迫响应基因的研究进展
• 4 蛋白质组学技术在植物环境胁迫响应机制中的应用
• 4.1 蛋白质组学的概念产生背景
• 4.2 蛋白质组学的方法和技术
• 4.2.1 蛋白质样品的制备
• 4.2.2 蛋白质组样品的分离
• 4.2.3 蛋白质的鉴定技术
• 4.2.4 生物信息学分析
• 4.3 植物环境胁迫的蛋白质组学研究进展
• 4.4 植物镉胁迫响应的蛋白质组学研究进展
• 5 本研究的目的与意义
• 第二部分 研究报告
• 第一章 适于双向电泳分析的萝卜蛋白质提取方法 #13体系建立
• 1 材料和方法
• 1.1 材料与主要试剂
• 1.2 萝卜叶片蛋白质提取方法
• 1.3 肉质根蛋白质提取方法优化
• 1.4 蛋白质的溶解与定量
• 1.5 电泳检测与图像采集
• 1.5.1 SDS-PAGE
• 1.5.2 双向电泳
• 2 结果分析
• 2.1 萝卜叶片总蛋白质产量与SDS-PAGE
• 2.2 不同方法提取的萝卜叶片蛋白质的2-DE图谱比较
• 2.3 肉质根蛋白的SDS-PAGE结果
• 3. 讨论
• 第二章 镉胁迫下萝卜叶片蛋白质的双向电泳分析
• 1. 材料和方法
• 1.1 材料与主要试剂
• 1.2 幼苗的培养与镉处理
• 1.3 萝卜叶片蛋白质提取
• 1.4 蛋白质溶解与定量
• 1.5 SDS-PAGE
• 1.6 双向电泳
• 1.7 考马斯亮蓝染色
• 1.8 图像采集与分析
• 2. 结果分析
• 2.1 镉胁迫下萝卜叶片的形态变化
• 2.2 镉胁迫下萝卜叶片蛋白质的SDS-PAGE与双向电泳分析
• 3 讨论
• 3.1 镉胁迫对萝卜叶片形态影响
• 3.2 镉胁迫对萝卜叶片蛋白质水平上的影响
• 第三章 镉胁迫下萝卜肉质根蛋白质双向电泳分析 #33与质谱鉴定
• 1 材料与方法
• 1.1 幼苗的培养与处理
• 1.2 蛋白质的提取
• 1.3 蛋白质溶解与定量
• 1.4 双向电泳
• 1.5 考马斯亮蓝染色
• 1.6 图像采集与分析
• 1.7 质谱鉴定与数据库检索
• 2. 结果分析
• 2.1 镉胁迫条件对萝卜肉质根生长发育的影响
• 2.2 镉胁迫条件下萝卜肉质根蛋白表达谱的双向电泳分析
• 2.3 部分差异蛋白质的质谱鉴定与功能分析
• 3 讨论
• 3.1 镉胁迫对萝卜肉质根生长发育的影响
• 3.2 萝卜肉质根蛋白质组响应镉胁迫反应分析
• 3.2.1 细胞防卫蛋白
• 3.2.2 信号转导相关蛋白
• 3.2.3 细胞代谢相关蛋白
• 3.2.4 未知功能蛋白
• 第四章 镉胁迫相关基因的克隆与表达分析
• 1 材料与方法
• 1.1 幼苗的培养与处理
• 1.2 基因组DNA提取
• 1.3 总RNA的提取
• 1.4 RNA纯化与检测
• 1.5 RNA反转录
• 1.6 引物设计与合成
• 1.7 基因克隆与序列分析
• 1.7.1 镉胁迫相关基因RsPGK、RsPDI、RsSOD的基因组DNA与cDNA扩增
• 1.7.2 目的片段的回收
• 1.7.3 大肠杆菌感受态的制备
• 1.7.4 重组质粒的构建
• 1.7.5 重组质粒的转化
• 1.8 序列测定及分析
• 1.9 半定量RT-PCR检测基因表达
• 2. 结果分析
• 2.1 萝卜镉胁迫相关基因的基因组DNA与cDNA扩增结果
• 2.2 RsPGK与RsPDI基因克隆的序列分析
• 2.3 RsSOD基因克隆与序列分析
• 2.4 萝卜RsPGK、RsPDI、RsSOD基因在转录水平的表达分析
• 3. 讨论
• 3.1 RsSOD基因对Cd胁迫的响应
• 3.2 RsPDI基因对Cd胁迫的响应
• 3.3 RsPGK基因对Cd胁迫的响应
• 3.4 转录水平与翻译水平的一致性
• 全文结论
• 参考文献
• 论文发表情况
• 致谢