猪流行性腹泻病毒（PEDV）木瓜样蛋白酶功能研究

论文摘要

冠状病毒是感染人和动物的一大类病毒。感染人类和动物的冠状病毒种类多样而且致病性和免疫特性存在明显差异。宿主在长期的进化过程中形成了一种抵抗病毒入侵的防御性抗病毒机制,即抗病毒天然免疫反应（innate immune response）。冠状病毒对宿主抗病毒天然免疫反应的调节机制至今不甚清楚。我们前期研究发现：人类新发冠状病毒SARS病毒和NL63病毒木瓜样蛋白酶（PLP）具有去泛素化酶（DUB）活性,而且是一种宿主干扰素拮抗剂。为了证实DUB活性和对宿主干扰素拮抗特性是所有冠状病毒木瓜样蛋白酶都具有的生物学特性,本研究以动物冠状病毒-猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus, PEDV）作为研究对象。研究发现PEDV感染宿主后不诱导IFN-p产生并且负调节IFN-p表达,同时PEDV抑制核转录因子IRF3活化通路；推测PEDV可能是通过抑制IRF3通路从而负调节宿主抗病毒干扰素表达通路。PEDV非结构蛋白nsp3编码两个木瓜样蛋白酶（PLP）PLP1和PLP2结构域,进一步研究发现,PEDV PLP1不具有DUB活性,对干扰素也无拮抗作用；PLP2是PEDV编码的去泛素化酶（DUB）,PLP2对K48和K63连接的多聚泛素化修饰均具有DUB活性,说明PLP2DUB活性对K48和K63连接的多聚泛素化无底物特异性。同时,将PLP2的蛋白酶催化活性位点C1729、H1888和D1901突变,突变后PLP2DUB活性明显被抑制,说明PLP2蛋白酶催化活性位点同时也是其DUB活性关键位点。此外,PLP2对仙台病毒激活的IFN-β表达具有明显抑制作用,说明PLP2是PEDV编码的一种干扰素拮抗剂,而且其干扰素拮抗功能与其蛋白酶催化活性密切相关。以上研究提示,PLP2能够负调节干扰素表达通路。那么PLP2是如何对宿主抗病毒干扰素表达通路进行调节?研究发现,PLP2抑制RIG-Ⅰ激活的IFN-β、NF-κB和IRF3通路,并且抑制STING激活的IFN-p和IRF3通路。进一步研究其机制发现,PLP2能够与宿主抗病毒天然免疫系统中的重要模式识别受体（PRR） RIG-I以及重要调节蛋白STING发生相互作用,通过对RIG-Ⅰ和STING的去泛素化负调节宿主抗病毒天然免疫反应。以上研究为阐明PEDV对宿主抗病毒天然免疫反应的调节作用和其致病机制提供了重要的理论依据,为开展PEDV新的免疫防治措施提供了重要理论基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 符号说明
• 第一章 文献综述
• 1 猪流行性腹泻病毒（PEDV）基因组结构及其复制周期
• 1.1 PEDV基因组结构
• 1.2 PEDV蛋白功能
• 1.3 PEDV复制周期
• 2 PEDV与细胞抗病毒天然免疫
• 2.1 细胞抗病毒天然免疫及其信号通路调节
• 2.2 PEDV与细胞抗病毒天然免疫
• 2.3 PEDV PLP蛋白酶与宿主抗病毒天然免疫
• 3 展望
• 第二章 实验材料与方法
• 1 实验材料
• 2 实验方法
• 第三章 实验结果与讨论
• 1 PEDv PLP表达载体及其蛋白酶催化活性位点突变体构建
• 1.1 前言
• 1.2 结果与分析
• 1.2.1 PEDV PLP1和PLP2的表达载体构建
• 1.2.1.1 PEDv PLP1和PLP2基因密码子优化
• 1.2.1.2 pUC57-PEDV PLP1（N）和pUC57-PEDV PLP2（N）酶切鉴定
• 1.2.1.3 pcDNA3.1-V5-PEDV PLP1（N）和PLP2（N）酶切鉴定
• 1.2.1.4 PEDV PLP1（N）)和PEDV PLP2（N）表达检测
• 1.2.2 PEDV PLP2蛋白酶催化活性位点突变体构建
• 1.2.2.1 PEDV PLP2蛋白酶催化活性位点突变体测序
• 1.2.2.2 PEDV PLP2蛋白酶催化活性位点突变体表达检测
• 2 PEDV PLP的去泛素化酶（DUB）活性
• 2.1 前言
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 PEDV PLP细胞内DUB活性
• 2.2.2 PEDV PLP2对不同连接形式泛素（Ub）的去泛素化活性
• 2.2.3 PEDV感染细胞中的去泛素化活性
• 3 PEDV PLP对宿主干扰素抗病毒天然免疫的调节作用
• 3.1 前言
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 PEDV负调节IFN-β表达信号通路
• 3.2.1.1 PEDV不诱导IFN-β产生
• 3.2.1.2 PEDV抑制dsRNA诱导的IFN-β产生
• 3.2.1.3 PEDV抑制IRF3信号通路激活
• 3.2.2 PEDV PLP2是PEDV编码的一种干扰素拮抗蛋白
• 3.2.2.1 PEDV PLP2负调节仙台病毒（seV）激活的IFN-β表达通路
• 3.2.2.2 PEDV PLP蛋白酶对IFN-β信号通路的抑制作用呈剂量效应关系
• 3.2.3 PEDV PLP2抑制调节蛋白（RIG-I/STING）激活的IFN-β干扰素表达
• 3.2.4 PEDV PLP2对IFN-β信号通路关键调节蛋白（RIG-I/STING）的去泛素化
• 4 结论与讨论
• 4.1 PEDV PLP蛋白酶表达载体及其蛋白酶活性位点突变体构建
• 4.2 PEDV对宿主细胞具有去泛素化作用,PLP2是PEDV编码的一种新型DUB
• 4.3 PEDV对IFN-β表达通路具有负调节作用,PLP2是PEDV编码的一种干扰素拮抗蛋白
• 4.4 PEDV PLP2负调节宿主抗病毒天然免疫反应分子机制
• 4.4.1 PLP2抑制调节蛋白（RIG-I/STING）激活的干扰素信号表达通路
• 4.4.2 PLP2通过对RIG-I和STING的去泛素化负调节宿主抗病毒天然免疫反应
• 参考文献
• 附录 各类试剂的配制
• 致谢