甘蓝型油菜脂肪酸去饱和相关基因的研究

论文摘要

1、以甘蓝型油菜湘油15为材料,随机挑选56个来自基因组的fad2基因克隆、47个来自幼苗整株的fad2基因gDNA克隆和9个授粉27天后种子中fad2 cDNA克隆进行双向测序。基因组中56个fad2序列的碱基同源性为91%～99.9%,从中得到11个差异序列,即11个不同的fad2基因拷贝。将其翻译成氨基酸序列发现,6个拷贝在编码区中出现多个终止密码子,另外5个的同源性为90.6%～99.74%,与47个来自幼苗整株的fad2基因cDNA序列进行比较,发现fad2基因没有内含子。从种子中的9个fad2 cDNA克隆序列中找到2个有差异的cDNA,它们的编码区中没有终止密码子,说明在种子中有多个fad2基因表达。基因组中的11个拷贝根据同源性可分成两组,命名为fad2Ⅰ和fad2Ⅱ。RT-PCR分析发现在授粉27天的种子中fad2Ⅰ有较强表达,fad2Ⅱ没有表达;但在叶片中两者都有表达。2、利用气相色谱检测了两个甘蓝型油菜EMS突变体（HO、LO）种子在发育成熟的不同阶段的脂肪酸组成情况。结果显示在发育的早期（授粉后前20天）HO和LO的油酸的含量都较低,在授粉后20-30天这一阶段油酸含量迅速增加,从小于5%增加至52%（LO）和65%（HO）。HO种子在授粉后10-27天里,HO种子中亚油酸含量明显高于LO种子中的含量,而在授粉后27-40天期间HO种子中亚油酸含量却低于LO种子中的含量。亚麻酸含量在LO中呈先降后缓慢上升状态,而在HO中亚麻酸含量则是先降后缓慢上升,在授粉后35天又快速下降。3、根据气相色谱测定的HO和LO种子发育成熟过程中脂肪酸累积情况,选择授粉后27天的HO和LO种子作为筛选与油酸性状及脂肪酸去饱和相关基因的研究材料。通过对两个材料的消减抑制杂交后,构建了差异表达基因cDNA文库,该文库中包括480个克隆。通过斑点杂交筛选,得到106个阳性克隆,占文库克隆总数的22.1%。对这106个阳性克隆进行了测序,得到88个有效uniESTs序列,BLASTN结果显示,73个uniESTs在拟南芥或油菜核酸数据库中能找到同源序列。BLASTX结果显示有19个uniESTs序列和已知功能的蛋白有高度相似性,其中相当部分是与基因表达相关的调控因子。其它69个uniESTs在GenBank中不能找到其氨基酸同源序列,这些EST序列可能是尚未报道的新基因。4、从19个已知功能的差异表达基因中选择4个基因:B461（硬脂酰-酰基载体蛋白脱氢酶基因）、B4（TCP家族转录因子）、B156（生长素诱导蛋白）、B16（转录因子）;从69个未知功能的基因中选择B57和B315（未知功能膜蛋白J10-2）,根据它们的序列,设计PCR引物,对其进一步进行RT-PCR分析。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 第一章 文献综述
• 1 植物脂肪酸组成调控的研究进展
• 1.1 植物脂肪酸脱饱和的基本途径
• 1.2 与植物脂肪酸脱饱和相关的酶及基因
• 1.2.1 去饱和酶的结构特点
• 1.2.2 脂肪酸脱饱和酶基因的克隆
• 1.3 油酸脱氢酶FAD2的研究进展
• 1.3.1 FAD2的性质
• 1.3.2 FAD2活性调节
• 1.3.3 FAD2基因家族
• 2 油菜脂肪酸研究进展
• 2.1 油菜脂肪酸品质主要目标
• 2.2 油菜脂肪酸成分及其遗传
• 2.3 油菜脂肪酸品质改良的主要途径
• 2.3.1 系统育种和杂交育种
• 2.3.2 诱变育种
• 2.3.3 脂肪酸基因工程
• 2.3.3.1 脂肪酸碳链长度调控
• 2.3.3.2 脂肪酸饱和度调控
• 3 消减抑制杂交（SSH）技术及其运用
• 3.1 抑制消减杂交技术的基本原理及主要步骤
• 3.2 SSH方法在植物上的应用
• 4 本研究的立题依据及技术路线
• 4.1 本研究立题依据
• 4.2 本研究技术路线
• 第二章 甘蓝型油菜fad2基因多个拷贝的分析
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 主要试剂
• 1.3 主要仪器
• 1.4 方法
• 1.4.1 CTAB法提取DNA
• 1.4.2 提取油菜总RNA
• 1.4.3 第一链cDNA的合成
• 1.4.4 高效感受态细胞的制备
• 1.4.5 湘油15号fad2基因的克隆
• 1.4.6 湘油15号fad2基因碱基序列的分析
• 1.4.7 设计序列差异引物进行RT-PCR分析
• 1.4.7.1 序列差异引物的验证
• 1.4.7.2 fad2基因的RT-PCR分析
• 2 结果与分析
• 2.1 总DNA及总RNA的提取效果
• 2.2 湘油15号fad2基因克隆序列的分析
• 2.3 fad2基因的RT-PCR分析结果
• 3 讨论
• 3.1 PCR产物测序发现基因多拷贝差异的可行性
• 3.2 fad2 Ⅰ组与fad2 Ⅱ组
• 3.3 fad2基因多拷贝在油菜高油酸育种中的意义
• 第三章 两个甘蓝型油菜突变材料种子发育过程中脂肪酸组成的研究
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 试剂
• 1.3 仪器
• 1.4 取样方法及甲酯化处理
• 1.5 气相色谱仪分析
• 2 结果及分析
• 2.1 各个脂肪酸的出峰时间
• 2.2 种子发育过程中脂肪酸组成的气相色谱测定结果
• 3 讨论
• 第四章 甘蓝型油菜（B.napus）油酸突变体消减cDNA文库的构建及差异表达基因的分析
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.2 主要试剂
• 1.3 主要仪器
• 1.4 方法
• 1.4.1 总RNA的提取
• 1.4.2 抑制消减杂交
• 1.4.2.1 第一链的合成
• 1.4.2.2 cDNA第一链的纯化
• 1.4.2.3 合成cDNA第二链
• 1.4.2.4 对第二链cDNA PCR产物进行纯化
• 1.4.2.5 Rsa Ⅰ酶解双链cDNA及纯化
• 1.4.2.6 接头连接
• 1.4.2.7 第一轮杂交
• 1.4.2.8 第二轮杂交
• 1.4.2.9 第一轮选择性PCR
• 1.4.2.10 第二轮选择性PCR
• 1.4.3 正向消减抑制杂交文库的构建
• 1.4.3.1 T-A克隆
• 1.4.4 点杂交对文库进行筛选
• 1.4.4.1 制备杂交探针
• 1.4.4.2 点膜
• 1.4.4.3 预杂交
• 1.4.4.4 杂交
• 1.4.4.5 洗膜
• 1.4.4.6 信号检测
• 1.4.4.7 差异表达克隆的确定
• 1.4.5 差异表达基因cDNA片段的测序、分析
• 1.4.6 差异表达基因的RT-PCR分析
• 2 结果
• 2.1 总RNA提取效果
• 2.2 第一链和第二链cDNA的合成
• 2.3 消减杂交
• 2.4 消减文库的构建和鉴定
• 2.4.1 差异片段的克隆和分析
• 2.4.2 斑点杂交结果
• 2.4.3 测序结果及分析
• 2.4.4 部分差异表达基因RT-PCR引物的设计
• 2.4.5 部分差异表达基因的RT-PCR分析结果
• 3 讨论
• 3.1 抑制消减杂交技术
• 3.2 硬脂酰-ACP脱氢酶对油酸的影响
• 3.3 文库中其他已知功能的cDNA的分析
• 3.4 影响油酸含量的因素是多方面的
• 全文总结和创新点
• 1 全文总结
• 2 本研究创新点
• 参考文献
• 致谢
• 作者简历
• 附录1 甘蓝型油菜湘油15基因组中11个fad2基因拷贝的序列比对
• 附录2 甘蓝型油菜湘油15基因组中11个FAD氨基酸序列比对
• 附录3 论文重要的英文缩写词