花特异启动子调控的蓝色基因表达载体构建及功能研究

论文摘要

百合（LiLium spp.）花姿秀美,花茎挺拔,是点缀庭院的名贵观赏花卉,是世界上著名的五大鲜切花之一,深受世界各国人民的喜爱。自然界的百合有白色、粉红色、红色、黄色等,但唯独缺乏蓝色。通过基因工程手段培育出蓝色百合新品系是目前花卉分子育种的研究重点。花色苷作为高等植物花色形成中最具影响力的因素,其生物合成途径已经研究得很清楚,大量相关基因已被克隆鉴定。为了探索百合蓝色花育种途径,前期工作中,我们从东方百合’Sorbonne’花瓣中克隆了查尔酮合成酶（CHS）启动子序列,并对其进行了初步验证;从风信子花瓣中克隆获得编码二氢黄酮醇4-还原酶的DFR基因序列;从蓝紫色矮牵牛花瓣中克隆获得编码类黄酮3’,5’羟基化酶的Hf 1基因序列;从矮牵牛花瓣中克隆获得编码B5蛋白编码的DifF基因序列。本试验在此基础上,构建了多基因表达载体,然后通过农杆菌介导法转化模式植物矮牵牛,以期为百合蓝色花育种提供参考和依据。本研究取得的主要结果如下:1.构建了多基因共表达载体将花特异表达启动子PchsA与矮牵牛中编码类黄酮3’,5’羟基化酶（F3’5’H）的Hf1基因融合,构建了百合花特异表达启动子调控的Hf1基因植物中间表达载体pCAM-Hf1,然后将DFR基因和DifF基因分别构建到载体pCAM-Hf1中,最终得到多基因共表达载体pCAM-Hf1-DFR和pCAM-Hf1-DifF。2.转化模式植物矮牵牛并进行PCR检测通过农杆菌介导的叶盘法转化矮牵牛,经潮霉素抗性筛选后获得若干阳性植株。采用CTAB法提取潮霉素阳性植株的总DNA,用查尔酮合成酶启动子、矮牵牛Hf1基因、风信子DFR基因或矮牵牛DifF基因的特异引物分别进行了PCR检测,转基因矮牵牛DNA分别扩增出了预期大小的特异PCR扩增片段,初步获得了转基因矮牵牛植株。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 百合花色改良研究概述
• 1.2 启动子概述
• 1.2.1 组成型启动子
• 1.2.2 组织特异性启动子
• 1.2.3 诱导型启动子
• 1.3 蓝色花形成机理及相关基因概述
• 1.3.1 类黄酮生物合成途径
• 1.3.2 蓝色花的形成
• 1.3.3 相关基因介绍及其研究进展
• 1.4 利用基因工程培育蓝色花的策略
• 1.4.1 基因工程改良花色的研究方法
• 1.4.2 蓝色花分子育种策略
• 1.5 农杆菌介导的植物多基因共转化
• 1.6 本实验的目的意义
• 第二章 试验材料与方法
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 菌种和载体
• 2.1.3 主要试剂药品和仪器设备
• 2.1.4 基本培养基
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 矮牵牛再生体系的建立
• 2.2.2 植物表达载体的构建
• 2.2.3 叶盘法转化矮牵牛
• 2.2.4 矮牵牛DNA 提取
• 2.2.5 转基因植株的PCR 检测
• 第三章 结果与分析
• 3.1 植物表达载体的构建
• 3.1.1 植物表达载体构建技术路线
• 3.1.2 PCR 扩增各目的基因片段
• 3.1.3 各目的基因片段克隆入pMD19-T 载体
• 3.1.4 植物中间表达载体构建
• 3.1.5 花特异启动子调控的蓝色基因双元载体构建
• 3.2 叶盘法转化矮牵牛
• 3.3 转化植株 PCR 检测
• 第四章 讨论
• 4.1 花特异启动子功能的研究
• 4.2 蓝色花形成的讨论及目的基因的选择依据
• 4.3 多基因植物表达载体的构建
• 4.4 转化受体的选择与试验中存在的困难
• 第五章 结论
• 参考文献
• 缩略词
• 致谢
• 作者简介