人血清白蛋白cDNA转化橡胶树的研究

论文摘要

人血清白蛋白（human serum albumin,HSA）是人血浆中最丰富的蛋白质,具有维持血液渗透压、运输营养物质等生理功能,在临床医学中应用十分广泛。而目前市售的HSA主要来源于捐血者的血浆,有限的血液资源和人血中可能存在的病原污染限制了HSA的临床使用。人们迫切期望通过新途径来开发HSA,而通过基因工程手段开发重组人血清白蛋白来替代血源白蛋白是发展前景良好的新途径。 与微生物生物反应器和动物生物反应器相比,植物生物反应器有其独特的优越性。橡胶树的乳管系统十分发达,类似于动物的乳腺系统,割胶后胶乳从乳管中排出,从而使其中的蛋白产物采收加工及分离纯化十分方便。选择合适的乳管表达基因启动子可以使外源基因在其中表达,从而把橡胶树乳管系统变成生产外源蛋白的理想生物反应器。基于这种设想,本研究对橡胶树遗传转化体系的建立进行研究,并把含有橡胶树REF启动子的HSA cDNA乳管表达载体分别通过基因枪转化法和农杆菌转化法,导入橡胶树愈伤组织中,得到了以下的结论: （1）以未成熟的雄花、内珠被和组织培养幼苗为外植体,用不同浓度的植物生长素和细胞分裂素组合,对外植体进行诱导,获得了大量的愈伤组织。 ①对未成熟的雄花来讲,其最佳的愈伤组织诱导培养基为:MS培养基+7.0%麦芽糖+4.0mg/L 2,4-D+0.2mg/L 6-BA+1.2mg/L PVP+1.0%琼脂（pH 5.8）,于25±1℃,黑暗培养:继代培养基:将碳源改为7.0%蔗糖,激素浓度调至原浓度的1/10,其他条件不变。 ②对橡胶树未成熟种子的愈伤组织来讲,其最佳培养基为:MS培养基+4.0mg/L 2,4-D+0.2mg/L KT+1.2mg/L PVP+7.0%麦芽糖+1.0%琼脂（pH5.8）,于25±1℃黑暗培养;继代培养时的激素浓度为诱导激素浓度的1/10,其他成分和培养条件不变。 ③对橡胶树组培苗来讲,其最佳的愈伤组织诱导培养基为:MS培养基+3g/L蔗糖+3g/L麦芽糖+2mg/L 2,4-D+1mg/L 6-BA+1.2mg/L PVP+1.0%琼脂（pH5.8）,于25±1℃黑暗培养:继代培养的激素浓度为诱导激素浓度的1/10,其他成分和培养条件不变。

论文目录

• 目录
• 1 前言
• 1.1 人血清白蛋白
• 1.1.1 人血清白蛋白简介
• 1.1.2 利用基因工程生产重组人血清白蛋白
• 1.2 植物生物反应器研究进展
• 1.2.1 植物生物反应器概念及优点
• 1.2.2 植物生物反应器研究进展
• 1.2.3 转基因植物生物反应器研究存在的主要问题
• 1.3 橡胶树生理学研究概况
• 1.3.1 橡胶树的乳管系统
• 1.3.2 产胶生理
• 1.4 橡胶树分子生物学研究概况
• 1.4.1 胶乳中的基因表达分析
• 1.4.2 胶乳合成相关基因克隆
• 1.4.3 橡胶种质资源的分子生物学研究
• 1.4.4 橡胶树基因工程
• 1.5 橡胶树遗传转化体系的研究
• 1.5.1 愈伤组织的培养
• 1.5.2 分化培养
• 1.5.3 体细胞胚的萌发
• 1.6 植物转基因方法
• 1.6.1 载体转化系统
• 1.6.2 DNA直接导入法
• 1.7 本研究的目的、意义、研究内容
• 2 材料与方法
• 2.1 技术路线
• 2.2 试剂与菌株
• 2.2.1 化学药品
• 2.2.2 溶液的配置
• 2.2.3 培养基
• 2.2.4 菌株
• 2.3 仪器设备
• 2.4 橡胶树再生体系的建立
• 2.4.1 橡胶树愈伤组织的诱导
• 2.4.2 橡胶树愈伤组织抗卡那霉素情况
• 2.4.3 橡胶树胚状体的诱导
• 2.4.4 橡胶树完整植株的诱导
• 2.5 基因枪法转化橡胶树愈伤组织
• 2.5.1 质粒的准备
• 2.5.2 基因枪轰击受体材料
• 2.5.3 轰击后愈伤组织的培养
• 2.5.4 转基因胚状体的诱导
• 2.5.5 转基因幼苗的诱导
• 2.6 转基因幼苗的PCR检测
• 2.6.1 微量法提取DNA
• 2.6.2 HSA cDNA的PCR检测
• 2.7 农杆菌侵染愈伤组织
• 2.7.1 三亲交配法将中间载体导入农杆菌
• 2.7.2 PCR方法检测转化的农杆菌GVRH
• 2.7.3 农杆菌的准备
• 2.7.4 侵染
• 2.7.5 共培养
• 2.7.6 筛选培养
• 2.7.7 转基因幼苗的诱导
• 2.8 转基因胚状体的PCR检测
• 3 结果与分析
• 3.1 橡胶树再生体系的建立
• 3.1.1 橡胶树愈伤组织的诱导
• 3.1.2 橡胶树愈伤组织抗卡那霉素情况
• 3.1.3 橡胶树胚状体的诱导研究
• 3.1.4 完整植株的诱导
• 3.2 基因枪轰击法转化橡胶树愈伤组织
• 3.2.1 基因枪轰击后的恢复培养
• 3.2.2 基因枪轰击距离对转化率的影响
• 3.2.3 抗性植株的获得
• 3.2.4 转化植株的PCR检测
• 3.3 农杆菌侵染愈伤组织
• 3.3.1 PCR方法检测三亲交配法获得的农杆菌
• 3.3.2 不同浓度的农杆菌侵染橡胶树愈伤组织的情况
• 3.3.3 抗性胚状体的获得
• 3.3.4 转基因胚状体的PCR检测
• 3.3.5 抗性植株的诱导情况
• 4 讨论
• 4.1 橡胶树愈伤组织诱导的研究
• 4.2 橡胶树愈伤组织转化方法的比较
• 5 结论
• 6 参考文献
• 7 缩略语表
• 8 致谢