猪舍环境气载需氧菌的检测及大肠杆菌气溶胶的发生与传播

论文摘要

微生物气溶胶是畜禽舍环境污染的重要因素之一,气溶胶的生物污染可以引起一系列传染病的流行。目前,对畜禽舍环境中气载微生物的研究,主要集中在某一特定时间段内和某些特定的病原菌上。关于畜禽舍环境中气载需氧菌在一年四季中的动态变化、分布规律以及其传播特点涉及较少。因此,本研究以山东省最常见的封闭式和半封闭式猪舍为研究对象,于2008年3月到2009年2月对其环境中气载需氧菌进行检测,并对其分布特征和危害进行了分析和评估;同时,以大肠杆菌为指示菌,利用其ERIC（Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus）序列的特点和对不同抗生素耐药性的差异,来分析不同来源大肠杆菌的同源性,从而揭示了微生物气溶胶传播的特点。本实验从2008年3月到2009年2月,以5%血琼脂培养基为采样介质,利用Andersen-6级微生物空气采样器收集猪舍环境中空气样品,然后通过培养计数,分析气载需氧菌浓度的动态变化和粒径分布特点。封闭式猪舍环境气载需氧菌浓度在9.07×104～28.23×104 CFU /m3空气;半封闭式猪舍环境气载需氧菌浓度为12.02×104～24.95×104 CFU /m3空气。冬季最高,夏季最低。气载需氧菌主要分布在采样器的A-D级上,F级最少。猪舍环境中气载需氧菌含量不仅高,而且季节性波动较大,每天约有4.0×105CFU和4.9×106 CFU气载需氧菌可分别进入人和猪的小支气管或直接侵入肺泡,从而对人及猪的健康构成潜在威胁。采用同一工作日由猪的粪便、舍内、外空气中分离到的大肠杆菌菌株,每个取样点取10株,选择氟哌酸（NOR）、头孢哌酮（CFP）、氯霉素（CMP）、复合磺胺（SXT）、庆大霉素（GEN）、链霉素（STR）、四环素（TET）、利福平（RIF）、红霉素（ERY）、青霉素（P-G）、妥布霉素（TOB）、呋喃妥因（Ni）十二种药敏纸片,进行耐药性测定。结果显示,猪舍内、舍外下风向空气中分离到的菌株都对RIF、ERY、P-G耐药,这在一定程度上可以证明舍内微生物气溶胶包括耐药细菌可随气体交换传播到周围环境中,使其周围环境受到微生物污染。采用Andersen-6级空气微生物样品收集器和RCS-离心式采样器分别在4个猪场舍内空气、舍外上风向10、50 m和下风向10、50、100、200、400 m不同距离收集大肠杆菌气溶胶,计算每一个采样点的大肠杆菌的浓度;与此同时,采集猪的粪便、分离大肠杆菌。利用ERIC-PCR鉴定技术,扩增不同测量点收集的大肠杆菌的DNA条带,形成聚类图谱。通过每一个采样点分离的大肠杆菌遗传相似性分析以及大肠杆菌浓度变化比较,确认动物舍微生物气溶胶向舍外环境的传播模式。结果显示:4个猪场舍内空气中大肠杆菌的浓度为21～35 CFU/m3空气,远远高于舍外上风和舍外下风处的大肠杆菌浓度（P<0.05）,但是舍外下风不同距离间的大肠杆菌浓度差异并不显著（P>0.05）。ERIC-PCR结果表明,52.4%粪便大肠杆菌（4个猪舍分别为:2/4, 50%; 2/4, 50%; 3/6, 50%; 4/7, 57.1%）与舍内空气中的大肠杆菌相似性可达90%以上;从猪场舍外下风方向分离到的多数大肠杆菌（55%）与舍内空气或粪便中分离的大肠杆菌相似性可达90%以上。由此得出,从上风分离到的多数大肠杆菌并非来源于动物的粪便或者舍内空气,而很多从舍内空气和舍外下风方向分离到的大肠杆菌来源于动物的粪便,说明源于动物舍的微生物气溶胶能够通过舍内外气体交换传播到舍外,因此,必须采取有效的措施控制和减少微生物气溶胶向周围环境的传播。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 引言
• 1.1 微生物气溶胶的概念
• 1.2 微生物气溶胶的危害
• 1.2.1 微生物气溶胶对畜牧业的危害
• 1.2.2 微生物气溶胶对人类健康的危害
• 1.3 微生物气溶胶的检测
• 1.3.1 Andersen 采样器
• 1.3.2 RCS 型采样器
• 1.4 微生物气溶胶学的应用
• 1.4.1 应用于动物疫病防治方面
• 1.4.2 应用于植物疫病防治方面
• 1.5 微生物气溶胶传播机制的研究
• 1.6 微生物气溶胶的国内外研究现状
• 1.6.1 微生物气溶胶的国内研究现状
• 1.6.2 微生物气溶胶的国外研究现状
• 1.7 研究背景
• 1.7.1 ERIC-PCR 技术
• 1.7.2 肠杆菌基因间重复共有序列（ERIC）的发现与分布
• 1.7.3 ERIC 结构特征及功能
• 1.7.4 ERIC-PCR 的原理及特点
• 1.7.5 ERIC-PCR 产物形成规律
• 1.7.6 ERIC-PCR 技术的应用
• 1.7.7 存在的问题和展望
• 1.8 本研究的目的及意义
• 2 材料和方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 猪场情况
• 2.1.2 主要试剂、选择性培养基
• 2.1.3 主要仪器设备
• 2.2 方法
• 2.2.1 样本的采集与处理
• 2.2.1.1 采样频率及样本的采集
• 2.2.1.2 空气样品的处理
• 2.2.1.3 粪便中大肠杆菌的分离与鉴定保存
• 2.2.2 大肠杆菌药敏实验
• 2.2.2.1 增菌
• 2.2.2.2 接种平板、贴药敏片
• 2.2.2.3 测量抑菌环直径
• 2.2.2.4 细菌药敏试验结果判定
• 2.2.3 ERIC-PCR 鉴定
• 2.2.3.1 模板的制备
• 2.2.3.2 ERIC-PCR
• 2.2.3.3 ERIC-PCR 结果分析
• 2.2.4 数据统计分析
• 2.2.5 需氧菌气溶胶潜在危害的评估
• 3 结果与分析
• 3.1 封闭式、半封闭式猪舍环境中气载需氧菌含量的动态变化
• 3.2 气载需氧菌在ANDERSEN-6 级收集器上的分布特征
• 3.3 气载需氧菌粒子的吸入量
• 3.4 猪舍空气中气载需氧菌的组成
• 3.5 猪舍环境中大肠杆菌药敏试验结果
• 3.6 4 个猪场舍内外不同距离空气中大肠杆菌含量
• 3.7 ERIC-PCR 结果
• 4 讨论
• 4.1 猪舍内环境微生物气溶胶的季节性动态变化
• 4.2 封闭式、半封闭式猪舍空气中气载需氧菌浓度的区别
• 4.3 猪舍微生物气溶胶粒子空气动力学直径（DAE50）分析及对动物及人的健康风险评估
• 4.4 鸡舍环境中大肠杆菌的耐药现状
• 4.5 猪舍内耐药性大肠杆菌向舍外环境中的传播
• 4.6 应用ERIC-PCR 鉴定大肠杆菌的同源性
• 5 结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表论文