论文摘要
拟除虫菊酯（pyrethroids,Py）作为目前应用较为广泛的杀虫剂之一,其对人体的毒性作用也日益引起普遍关注,大量研究表明,拟除虫菊酯是一种神经毒剂,且主要表现为兴奋性神经毒作用。但目前其确切的神经毒作用机制仍不十分清楚。本室对Ⅱ型拟除虫菊酯类农药溴氰菊酯（deltamethrin,DM）的神经毒性的研究显示DM染毒可以使大鼠脑组织神经细胞[Ca2+]i明显升高,改变Caspase-3活性,诱导大鼠脑组织神经细胞凋亡。细胞凋亡是为维持内环境稳定,由基因控制的细胞自主有序性的死亡。它是细胞正常生长的一种生理调节方式。细胞凋亡机制表现出高度的保守性,若该过程发生错误,可能会导致癌症、自身免疫失调、神经退行性疾病等多种病变。线粒体是真核生物能量和代谢的中心,也是细胞凋亡信号传导途径中起关键作用的细胞器,越来越多的研究表明,在凋亡信号的刺激下,线粒体发生膨胀,其外膜膜电位降低,外膜破裂后释放出膜间隙的诸多凋亡效应因子,在细胞凋亡中起着主开关的作用。作为细胞生死开关的线粒体通透性转变孔的长时间开放,细胞色素C、凋亡诱导因子、Ca2+以及膜间隙中的其他凋亡因子被释放至细胞质中,它们或激活凋亡蛋白家族的主要成员———胱冬肽酶,或独立地破坏核内染色质,或作用于其他Ca2+依赖性蛋白,从而使整个细胞的结构破坏、功能紊乱,最后细胞变成泡状凋亡小体而凋亡。本文在以往DM的神经毒性作用机理研究的基础上,从整体和体外试验两个方面,利用现代生物化学和分子生物学方法和技术,重点探讨线粒体介导的细胞凋亡信号转导机制,进一步完善DM的神经毒作用机理研究,并为中毒的预防和治疗提供理论依据。第一部分溴氰菊酯对神经细胞线粒体形态和功能的影响目的:观察溴氰菊酯对神经细胞线粒体形态和功能的影响。方法:采用溴氰菊酯（DM 12.5 mg/kg体重,溶剂色拉油）对雄性Wistar大鼠一次腹腔注射染毒,5 h后处死,透射电镜观察大鼠脑皮层和海马线粒体形态的改变;染毒后5 h、24 h、48 h、72 h处死,分光光度法分别检测大鼠脑皮层和海马线粒体琥珀酸脱氢酶（SDH）、Na+-Ka+、Ca2+-Mg2+-ATP酶活力;荧光分光光度法检测大鼠脑皮层和海马线粒体膜流动性。结果:大鼠经DM处理后,电镜照片上可见染毒组线粒体形态发生明显改变,线粒体数目减少,体积肿胀,嵴溶解、断裂,对照组线粒体形态正常。5 h、24 h、48 h、72 h组的线粒体琥珀酸脱氢酶和Na+-K+、Ca2+-Mg2+-ATP酶活力受到抑制,膜粘滞系数增大。皮层部位,SDH活力分别下降了40%、42%、55%、37%,Na+-K+-ATP酶活力分别降低了23%、59%、68%、54%,Ca2+-Mg2+-ATP酶活力分别降低了33%、51%、53%、49%,线粒体膜粘滞系数分别增大了40%、50%、50%、34%;海马部位,SDH活力分别下降了23%、15%、29%、19%,Na+-K+-ATP酶活力分别下降了24%、39%、73%、66%,Ca2+-Mg2+-ATP酶活力分别降低了45%、62%、71%、65%,线粒体膜粘滞系数分别增大了48%、69%、75%、72%,与对照组相比,其差异均具有统计学意义（P<0.01）。结论:在本实验条件下,从形态学、生物化学和生物物理学角度观察,发现DM能改变神经细胞线粒体的形态,使神经细胞线粒体琥珀酸脱氢酶、Na+-K+、Ca2+-Mg2+-ATP酶活力受到抑制,膜流动性降低,大脑皮层和海马部位受损的情况相似。第二部分溴氰菊酯对神经细胞线粒体膜通透性和膜电位的影响目的:分析溴氰菊酯对神经细胞线粒体膜通透性和膜电位的影响。方法:整体实验中,成年雄性Wistar大鼠一次性腹腔注射12.5 mg/kg体重DM（溶剂色拉油）,5 h、24 h、48 h、72 h后处死,提取皮层和海马的线粒体,采用分光光度法测定线粒体膜通透性和细胞色素C氧化酶活力,FCM法测定大鼠皮层和海马线粒体膜电位;体外实验中,建立大鼠神经胶质细胞模型,MTT法观察分别经10-8～10-3 mol/L浓度范围内的DM处理和1μmol/L环孢酶素A（CsA）处理后,大鼠神经胶质细胞的存活率,采用FCM法测定DM染毒及DM、CsA联合处理后大鼠神经胶质细胞线粒体膜电位。结果:整体实验中,大鼠经DM处理后,不同时间点大鼠脑皮层和海马线粒体细胞色素C氧化酶的活性受到抑制,与对照组相比,差异均有统计学意义（P < 0.01）;OD540值也明显下降,皮层部位,以5 h组下降幅度最大;海马部位,以48 h组下降幅度最大,与对照组相比,差异均有统计学意义（P < 0.01）,各组线粒体分别经25、50μmol/L CaCl2、先加2μmol/L CsA再加50μmol/L CaCl2处理后,OD540值发生改变。与未处理组相比,单纯加CaCl2组,OD540明显下降,差异有统计学意义（P < 0.01）,但两个浓度的Ca2+诱导组之间,OD540并无明显区别,差异无统计学意义（P > 0.05）;而经CsA处理再加50μmol/L组的OD540明显回升,与未处理组相比无明显改变,差异无统计学意义（P > 0.05）;皮层和海马的各时间点线粒体膜电位下降,与对照组相比,差异有统计学意义（P < 0.01）。DM作用于大鼠神经胶质细胞后,在5 h时间点,1×10-7～10-3 mol/L DM染毒组细胞的存活率分别为148.18%,140.77%,124.15%,92.25%和77.12%;在24 h时间点,各剂量组细胞存活率分别为100%,97.89%,91.76%,86.39%和51.34%;在48 h时间点,各染毒组细胞存活率为69.11%,53.96%,44.55%,13.37%及10.38%;而在染毒后72 h,各剂量组细胞的存活率仅为13.76%,23.34%,8.62%,3.17%以及0.78%。;经DM处理后,与对照组相比,中、高剂量组大鼠神经胶质细胞的线粒体膜电位明显下降,低剂量组无明显变化;经CsA阻断后,中、高剂量组神经胶质细胞线粒体膜电位无明显变化。结论:整体实验,DM染毒后,大鼠脑皮层和海马线粒体膜电位下降,膜通透性增大, Ca2+能诱导线粒体膜通透性增大,CsA可阻断Ca2+的诱导作用。体外实验,DM对大鼠神经胶质细胞线粒体膜电位下降,并有一定的剂量效应关系,CsA可阻断这种作用,提示DM可通过使线粒体膜通透性增大,膜电位下降来影响细胞凋亡的线粒体途径。第三部分溴氰菊酯对神经细胞线粒体细胞色素C释放的影响目的:探讨溴氰菊酯对神经细胞线粒体细胞色素C释放的影响。方法:体内实验中,免疫蛋白印迹法测定大鼠脑皮层和海马线粒体、胞浆细胞色素C的表达,免疫组织化学法测定大鼠脑皮层和海马CA1、CA2、CA3、CA4区细胞色素C的表达。体外实验中,免疫蛋白印迹法和免疫荧光细胞化学法测定大鼠神经胶质细胞细胞色素C的表达。结果:整体实验免疫蛋白印迹的结果显示,经DM处理后,不同时间点,大鼠脑皮层和海马线粒体细胞色素C表达降低,胞浆中表达增强,与对照组相比,差异有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01）;免疫组织化学的结果显示,经DM处理后,皮层,海马CA1区,CA2区5 h、24 h、48 h组,CA4区24 h组细胞色素C表达增强,吸光度值的差异有统计学意义（P<0.05或P<0.01）,CA2区72 h组、CA3区、CA4区5 h、48 h、72 h组细胞色素C表达,吸光度值的差异无统计学意义（P>0.05）;体外实验免疫蛋白印迹和免疫荧光细胞化学结果显示,中、高剂量组神经细胞细胞色素C表达增强,与对照组相比,差异有统计学意义（P<0.01）,低剂量组的表达则无明显变化,而预先经CsA处理后,DM则未能使表达增强。结论:DM可使大鼠脑皮层和海马神经细胞细胞色素C释放增加,表现为线粒体细胞色素C表达水平降低,而胞浆内表达增强;在体外实验模型大鼠神经胶质细胞中,亦可见DM增加细胞色素C释放,呈一定的剂量效应关系,且CsA能拮抗这种作用,提示DM可增加细胞色素C通过线粒体膜通透性转换孔的释放,从而经线粒体途径影响神经细胞的凋亡。第四部分溴氰菊酯对大鼠神经胶质细胞Caspase-3表达的影响目的:研究溴氰菊酯对大鼠神经胶质细胞Caspase-3表达的影响。方法:采用1×10-6 mol/L DM、1×10（-5） mol/L DM、1×10-4 mol/L DM、1×10-5 mol/L DM + 1μmol/L CsA、1×10-4 mol/L DM + 1μmol/L CsA处理大鼠神经胶质细胞后,用比色法和RT-PCR法检测Caspase-3的活性及mRNA的表达。结果:经DM单独处理后,与对照组相比,高剂量组大鼠神经胶质细胞的Caspase-3的活性和mRNA表达明显增强,差异有统计学意义（P<0.01）,低、中剂量组则无明显改变;DM+CsA联合处理后,神经胶质细胞的Caspase-3的活性和mRNA表达无明显改变。结论:在神经胶质细胞培养模型中,DM可使神经细胞Caspase-3的活性升高,其机制可能是mRNA的表达增强;给予一定剂量的CsA,可使DM增加Caspase-3活性作用消失,DM诱导线粒体释放的细胞色素C通过Caspase途径导致神经细胞凋亡。第五部分溴氰菊酯对大鼠神经胶质细胞凋亡的影响目的:观察溴氰菊酯对大鼠神经胶质细胞凋亡的影响。方法:采用1×10-6 mol/L DM、1×10-5 mol/L DM、1×10-4 mol/L DM、1×10-5 mol/L DM +1μmol/L CsA、1×10-4 mol/L DM + 1μmol/L CsA处理大鼠神经胶质细胞后,用FCM测定细胞凋亡率。结果:经DM单独处理后,与对照组相比,高剂量组大鼠神经胶质细胞的凋亡率上升,差异有统计学意义（P<0.01）,低、中剂量组则无明显改变;DM+CsA联合处理后,神经胶质细胞的凋亡率无明显改变。结论:CsA可拮抗DM诱导大鼠神经细胞凋亡,提示DM可能通过线粒体途径的介导,诱导神经细胞凋亡。
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