胸膜肺炎放线杆菌毒素蛋白的克隆表达及多重荧光PCR诊断方法的研究

论文摘要

猪传染性胸膜肺炎（Porcine contagious pleuropneumonia,PCP）是由胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae,APP）引起的一种猪的高度接触性传染病,针对胸膜肺炎放线杆菌血清型众多,现有疫苗缺乏交叉保护力,对规模化养猪业造成巨大经济损失的现状,研究开发具有交叉保护力的新型疫苗迫在眉睫。研究发现Apx毒素是APP的主要保护性抗原,可提高疫苗灭活疫苗的保护作用。天然毒素提取产量低、过程繁琐且成本较高,利用体外克隆表达编码Apx毒素结构蛋白的基因,获得的重组蛋白与天然提取的毒素免疫原性无明显差异,可为下一步新型疫苗多肽成分和ELISA诊断抗原的研究做充分准备。ApxⅣ是近年新发现的一个具有APP种属特异性的抗原,只存在于自然感染的动物体内,不会与其它放线杆菌和革兰氏阴性杆菌发生交叉反应。编码ApxⅣ毒素结构蛋白的apxⅣA基因C端特异性和保守性均很强,是首选的诊断抗原和靶基因。本研究运用蛋白质软件Anthe 5.0分析了APP的两个关键毒力因子ApxⅠA和ApxⅡA的抗原性和亲水性,截取其中主要抗原位点相对集中的核心区域,分别从胸膜肺炎放线杆菌血清1型国内参考株259和血清7型国内参考株265中扩增了apxⅠA和apxⅡA毒素基因,进行体外克隆,构建了原核表达载体pGEX-4T-1/apxⅠA和pET32a/apxⅡA以及真核表达载体pPICZαA/apxⅠA;并用T4连接酶串连apxⅠA和apxⅡA基因,构建了该融合基因的原核表达载体pGEX-4T-1/apxⅠA-apxⅡA;从胸膜肺炎放线杆菌血清1型国内参考株259中扩增apxⅣA毒素C端特异和保守的一段基因,进行体外克隆,构建了原核表达载体pGEX-4T-1/apxⅣA。以上四个原核表达载体分别在大肠杆菌DH5α、BL21和Top10’F中以IPTG进行诱导表达,ApxⅠA、ApxⅡA、ApxⅠA-ApxⅡA及ApxⅣA在大肠杆菌中均以包涵体形式表达,表达的重组融合蛋白分别占菌体总蛋白的32%、23%、19%和40%,利用溶菌酶和超声波对重组菌进行分次裂解,除去大部分可溶的菌体蛋白,再用Glutathione Sepharose 4B或Ni-NTA对相应产物进行进一步过柱纯化,最终获得的重组融合蛋白纯度在92%～98%之间,Western-blot的结果表明以上蛋白均具有良好的反应原性,可直接用于ELISA诊断抗原或新型疫苗多肽成分的研究。ApxⅠA的真核表达载体经甲醇诱导,在毕赤酵母GS115中以低水平分泌表达至培养液上清,经40倍浓缩才能检测到目的蛋白,同时从重组酵母总RNA中检测到apxⅠA基因的mRNA,可以证实目的基因发生了转录。经分析,造成apxⅠA基因在毕赤酵母系统中低水平表达的原因可能是:一、组成目的基因的密码子对于毕赤酵母的偏好指数极低;二、大量的酵母稀有密码子使得目的基因中tRNA丰度较低,导致翻译过程出现瓶颈效应;三、目的基因的高AT含量使酵母表达的转录提前终止。猪传染性胸膜肺炎和猪圆环病毒Ⅱ型在临床上共感染较为普遍,都以侵害呼吸系统为主,根据胸膜肺炎放线杆菌apxⅣA基因和猪圆环病毒Ⅱ型ORF2基因中最特异最保守的片段分别设计引物和荧光标记TaqMan探针,建立了可同时鉴别诊断猪传染性胸膜肺炎和猪圆环病毒Ⅱ型的实时定量荧光PCR方法,与其它经常发生混合感染的猪繁殖呼吸障碍综合征病毒（PRRSV）、猪瘟病毒（HCV）、伪狂犬病毒（PRV）、副猪嗜血杆菌（HP）、多杀性巴氏杆菌、大肠杆菌、链球菌等病原体均无交叉反应。该方法用于检测APP和PCV2 DNA的敏感度分别达到1×101拷贝和1×100拷贝,并且在两种病原的模板浓度相差105个拷贝时仍可以同时被检出。建立了APP和PCV2两种单重的TaqMan探针荧光实时定量PCR检测方法。所建立的诊断方法快速便捷、特异性好、敏感度高,对早期的快速诊断和筛查以及病原的净化具有很高的实用价值。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 目录
• 前言
• 第一部分 文献综述
• 1.1 猪传染性胸膜肺炎流行病学
• 1.1.1 猪传染性胸膜肺炎流行情况
• 1.1.2 猪传染性胸膜肺炎的传播及危害
• 1.2 猪传染性胸膜肺炎病原学
• 1.2.1 猪传染性胸膜肺炎放线杆菌的分类
• 1.2.2 胸膜肺炎放线杆菌的理化特性
• 1.2.3 胸膜肺炎放线杆菌的血清型分型
• 1.3 胸膜肺炎放线杆菌主要毒力因子及致病机理
• 1.3.1 Apx毒素
• 1.3.1.1 ApxⅠ毒素
• 1.3.1.2 ApxⅡ毒素
• 1.3.1.3 ApxⅢ毒素
• 1.3.1.4 ApxⅣ毒素
• 1.3.2 荚膜（Capsule,CP）
• 1.3.3 脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）
• 1.3.4 外膜蛋白（outer membrane proteins,OMP）
• 1.3.5 转铁结合蛋白（transferrin binding proteins,TBP）
• 1.3.6 其他
• 1.4 猪传染性胸膜肺炎诊断方法研究进展
• 1.4.1 病原分离鉴定
• 1.4.2 血清学诊断方法
• 1.4.2.1 补体结合试验（Complement Fixation Test,CFT）
• 1.4.2.2 酶联免疫吸附试验（Enzyme-linked Immunonsorbert Assay,ELISA）
• 1.4.2.3 凝集试验
• 1.4.2.4 间接血凝试验（Indirect Hemagglntination Assay,IHA）
• 1.4.2.5 间接荧光抗体试验（Indirect Fluorescence Antibody Assay,IFA）
• 1.4.2.6 乳胶凝集试验（Latex Agglutination Test,LAT）
• 1.4.2.7 环状沉淀试验（Ring Prepitation Test）
• 1.4.2.8 免疫扩散试验（Immunodiffusion Test）
• 1.4.3 分子生物学诊断方法
• 1.4.3.1 聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction,PCR）
• 1.4.3.2 实时荧光定量PCR
• 1.4.3.3 DNA杂交试验
• 1.5 猪传染性胸膜肺炎疫苗研究进展
• 1.5.1 灭活苗
• 1.5.2 弱毒苗
• 1.5.3 亚单位疫苗
• 1.5.4 核酸疫苗
• 1.5.5 展望
• 第二部分 胸膜肺炎放线杆菌apxⅠA、apxⅡA、apxⅣA基因的克隆表达
• 概述
• 实验研究一 胸膜肺炎放线杆菌apxⅠA基因在大肠杆菌中的克隆表达及重组蛋白的纯化
• 1 材料与方法
• 1.1 菌种、质粒和试剂
• 1.2 APP基因组DNA的提取
• 1.3 APP259标准阳性血清的制备
• 1.4 ApxⅠA表达载体的构建
• 1.5 apxⅠA基因在大肠杆菌DH5α中的表达
• 1.6 包涵体的溶解及复性
• 1.7 GST重组融合蛋白过柱纯化
• 2 结果
• 2.1 ApxⅠA蛋白的特性分析
• 2.2 apxⅠA基因的PCR扩增及测序
• 2.3 重组质粒pGEX-4T-1/apxⅠA的鉴定
• 2.4 apxⅠA基因在大肠杆菌DH5α中的表达
• 2.5 包涵体的溶解及复性
• 2.6 GST融合蛋白的过柱纯化及浓度测定
• 3 讨论
• 实验研究二 胸膜肺炎放线杆菌apxⅠA基因在毕赤酵母中的表达与分析
• 1 材料与方法
• 1.1 菌种、质粒和试剂
• 1.2 培养基的配制
• 1.3 PCR模板的制备
• 1.4 引物的设计和合成
• 1.5 apxⅠA基因的扩增及测序:
• 1.6 ApxⅠA真核表达载体的构建
• 1.7 分析apxⅠA基因密码子及预测相关表达特性
• 1.8 ApxⅠA在毕赤酵母GS115中的表达及检测
• 2 结果
• 2.1 apxⅠA基因的PCR扩增及测序
• 2.2 apxⅠA基因真核表达载体的构建
• 2.3 分析apxⅠA基因密码子及预测相关表达特性
• 2.4 apxⅠA基因的表达及检测
• 3 讨论
• 实验研究三 胸膜肺炎放线杆菌apxⅡA基因在大肠杆菌中的克隆表达及重组蛋白的纯化
• 1 材料与方法
• 1.1 菌种、质粒和试剂
• 1.2 APP基因组DNA的提取
• 1.3 APP265阳性血清的制备
• 1.4 ApxⅡA表达载体的构建
• 1.4.1 引物的设计和合成
• 1.4.2 apxⅡA基因的扩增及测序:
• 1.4.3 apxⅡA基因原核表达载体的构建
• 1.5 apxⅡA基因在大肠杆菌DH5α中的表达
• 1.6 包涵体的洗涤、溶解和复性
• 1.7 6×His重组融合蛋白过柱纯化
• 2 结果
• 2.1 ApxⅡA蛋白的特性分析
• 2.2 apxⅡA基因的PCR扩增及测序
• 2.3 重组质粒pET32a/apxⅡA的鉴定
• 2.4 apxⅡA基因在大肠杆菌BL21中的表达
• 2.5 包涵体的溶解及复性
• 2.6 6×His融合蛋白的过柱纯化及浓度测定
• 3 讨论
• 实验研究四 胸膜肺炎放线杆菌apxⅣA基因在大肠杆菌中的克隆表达及重组蛋白的纯化
• 1 材料与方法
• 1.1 菌种、质粒和试剂
• 1.2 APP基因组DNA的提取
• 1.3 APP259活菌阳性血清的制备
• 1.4 ApxⅣA表达载体的构建
• 1.4.1 引物的设计和合成
• 1.4.2 apxⅣA基因的扩增及测序:
• 1.4.3 apxⅣA基因原核表达载体的构建
• 1.5 apxIVA基因在大肠杆菌DH5α中的表达
• 1.6 包涵体的溶解及复性
• 1.7 GST重组融合蛋白过柱纯化
• 2 结果
• 2.1 apxⅣA基因的PCR扩增及测序
• 2.2 重组质粒pGEX-4T-1/apxⅣA的鉴定
• 2.3 apxⅣA基因在大肠杆菌DH5α中的表达
• 2.4 包涵体的溶解及复性
• 2.5 GST融合蛋白的过柱纯化及浓度测定
• 3 讨论
• 实验研究五 胸膜肺炎放线杆菌apxⅠA-apxⅡA融合基因在大肠杆菌中的共表达
• 1 材料与方法
• 1.1 菌种、质粒和试剂
• 1.2 APP基因组DNA的提取
• 1.3 ApxⅠA和ApxⅡA共表达载体的构建
• 1.3.1 引物的设计和合成
• 1.3.2 apxⅠA和apxⅡA基因的扩增及测序:
• 1.3.3 apxⅠA和apxⅡA基因共表达载体的构建
• 1.4 ApxⅠA和ApxⅡA在大肠杆菌Top 10'F中的共表达
• 1.5 包涵体的溶解及复性
• 1.6 GST重组融合蛋白过柱纯化
• 2 结果
• 2.1 apxⅠA和apxⅡA基因的PCR扩增及测序
• 2.2 重组质粒pGEX-4T-1/apxⅠA-apxⅡA的鉴定
• 2.3 ApxⅠA和ApxⅡA在大肠杆菌Top 10'F中的共表达
• 2.4 包涵体的溶解及复性
• 2.5 GST融合蛋白的过柱纯化及浓度测定
• 3 讨论
• 第三部分 多重实时定量PCR鉴别诊断猪传染性胸膜肺炎和猪圆环病毒Ⅱ型方法的建立
• 1 材料与方法
• 1.1 菌株及病毒
• 1.2 引物及探针设计
• 1.3 APP和PCV2 DNA模板的制备
• 1.4 重组质粒的制备
• 1.5 反应体系的优化
• 1.6 颜色补偿试验
• 1.7 标准曲线的建立和直线回归方程的确定
• 1.8 特异性、敏感性、稳定性和干扰性分析
• 1.8.1 特异性试验
• 1.8.2 敏感性试验
• 1.8.3 稳定性试验
• 1.8.4 干扰性试验
• 2 结果
• 2.1 APP apxⅣA和PCV2 ORF2部分基因片段的扩增及重组质粒的构建
• 2.2 标准曲线的建立和直线回归方程的确定
• 2.3 特异性、敏感性、稳定性和干扰性试验
• 2.3.1 特异性试验
• 2.3.2 敏感性试验
• 2.3.3 稳定性试验
• 2.3.4 干扰性试验
• 3 讨论
• 结论与展望
• 参考文献
• 实验用主要溶液的配制
• 致谢
• 个人简历
• 攻读学位期间发表论文情况