论文摘要
女性避孕药已经成功应用了六十多年,但至今仍无安全、有效、无副作用的男性避孕药面市。目前处于研究阶段的男性避孕药主要以甾体激素类药物为主,但其不能完全有效、起效时间长、用药方式（注射或皮下植入）不便等,为其推广造成了很大障碍。本实验室通过多年研究,发现低剂量棉酚与甾体激素联合应用可以使大鼠较快、较好地达到抗生育效果,同时避免了单独使用其中一种可能造成的一系列副作用的出现。经过多年筛选,我们确定了低剂量棉酚与可口服的甾体激素——去氧孕烯+炔雌醇+十一酸睾酮的联合用药方案。这个方案既能使全部受试大鼠在8w内达到不育,又无明显的毒副作用,但其作用靶点尚未阐明。大鼠随机分为四组,喂服棉酚12.5mg/kg·d+去氧孕烯0.125mg/kg·d+炔雌醇0.025mg/kg·d+十一酸睾酮100mg/kg·d的联合用药组（GH组）,单独喂服相同剂量的棉酚组（G组）、单独喂服相同剂量的激素组（H组）以及喂服载体溶剂的阴性对照组（C组）。分别于用药后4、6、8和10w取材,通过形态学观察、组织匀浆计数精子数量、免疫组化染色、TUNEL原位细胞凋亡检测、油红O染色、Western blotting. RT-PCR及体外培养生精小管等多种方法,分别对精子发生过程中可能受到干扰的环节进行检测,通过对各实验组结果的比较,探讨联合用药抗生育的具体作用环节以及棉酚和激素在用药过程中各自所起的作用。结果发现：GH组每克睾丸组织所含的精子数量随用药时间增加而明显下降,从4w时的与C组水平相当下降到10w时的只有C组的26.4%；H组的精子数量下降的幅度虽然比GH组小,但到10w时数值已与GH组接近；而G组一直没有明显变化。对睾丸组织切片的观察也证实GH组和H组的生精细胞随着实验时间的增加而逐渐减少,尤其以长形精子细胞最为明显。8w时GH组近一半的生精小管中不含长形精子细胞,而此时H组大约只有10%的小管出现改变。到10w时H组长形精子细胞的数量明显下降,GH组和H组之间的差异消失。此外,GH组和H组的初级精母细胞及圆形精子细胞的数量也不断减少。与此同时,我们观察到GH组和H组附睾头内的成熟精子数量明显减少,却有大量圆形的生精细胞出现。G组的睾丸精子数量以及睾丸形态结构方面都未见与C组有明显差别。以上结果提示,GH组和H组的生精过程受到了干扰,致使发育到成熟阶段的精子数量下降。通过对生精细胞增殖情况的检查,发现各用药组Ⅶ-Ⅷ期生精小管中的PCNA阳性细胞（精原细胞和细线前期的初级精母细胞）的数量基本无明显变化,说明三个用药组中精原细胞的增殖、分化未受到明显抑制。TUNEL染色检查凋亡时发现从4w开始GH组和H组的凋亡细胞就明显增多,而且随用药时间延长而不断增加,10w时已分别达到C组的66倍和55.8倍了。凋亡主要发生在Ⅶ-Ⅷ期生精小管,主要的凋亡细胞种类为粗线期初级精母细胞,另外也有一些圆形精子细胞发生凋亡。GH组与H组的多个结果相近,比如凋亡细胞的总数、主要凋亡细胞类型和凋亡发生的主要阶段等,但Ⅸ-Ⅵ期生精小管中GH组的凋亡细胞比H组多。这说明GH组的细胞凋亡可能主要是激素作用导致的,而棉酚可能在此基础上有强化作用。G组凋亡细胞的数量与C组相近,另外整个实验过程中未发现精原细胞、间质细胞和支持细胞凋亡。GH组和H组生精细胞大量凋亡可能是这两组生精上皮中细胞减少的原因之一。支持细胞有吞噬并降解凋亡细胞的能力,生精上皮内的脂滴增多常意味着被吞噬的凋亡细胞增多。油红O染色结果显示GH组和H组生精上皮中的脂滴面积明显增多,而G组的脂滴面积没有发生明显改变。该结果间接证明GH组和H组大量凋亡的细胞被支持细胞所吞噬,支持细胞的吞噬能力未受到明显抑制。GH组和H组附睾管中出现的大量圆形生精细胞,提示生精细胞与支持细胞之间的粘附可能发生改变,致使大量未成熟的生精细胞提前脱落,因此我们对部分粘附分子在睾丸内的表达情况进行检测。Western blotting和免疫组化的结果显示：GH组和H组的N-钙粘蛋白的蛋白表达水平升高,并有随时间继续上升的趋势,尤其以生精上皮中间层细胞（圆形精子细胞或初级精母细胞）之间的表达增加得更为明显。RT-PCR检测也发现这两组的N-钙粘蛋白mRNA转录水平在8w时比C组高,但各组间没有显著差异。同时,免疫组化结果显示：整合素α6在GH组和H组的Ⅳ-Ⅷ期小管中圆形精子细胞之间的表达也随时间增加而不断增强。但是,整合素p1的变化趋势与以上两种粘附分子不同,它在GH组和H组生精上皮中间层的表达呈现下降趋势,其中GH组下降的幅度更大。G组除了在Ⅸ-XIV期小管初级精母细胞的表达明显比C组低外,其它阶段都与C组类似。以上3个粘附分子中只有整合素β1在中间层生精上皮的表达呈下降趋势,提示整合素β1与生精细胞的脱落关系更为密切,而N-钙粘蛋白和整合素α6的表达增加可能是由于生精细胞大量脱落而导致机体出现的代偿反应。GH组比H组更为明显的整合素p1的表达减少则提示棉酚可能在激素影响粘附分子表达的基础上有进一步的协同作用。我们在睾丸组织切片还观察到4-6W时,GH组和H组位于Ⅶ-Ⅷ期生精小管腔面的19期精子细胞明显减少,但Ⅸ—Ⅺ期的小管腔面却又有一些精子细胞未能释放；与此同时,Ⅶ-Ⅻ期生精上皮的基底部精子头的数量明显比C组多。G组一直没有明显改变。以上结果提示GH组和H组的19期精子细胞与支持细胞之间的粘附可能发生改变,或者19期精子细胞本身出现异常而被支持细胞大量吞噬。无论哪个原因都可以造成管腔面19期精子细胞数量的减少,而这一现象的出现可能主要是激素作用的结果。TUNEL法未检测到长形精子细胞出现凋亡、另外我们也未发现所检测的3个粘附分子在19期精子细胞周围有明显改变,此处发生的改变还需要进一步检测。体外实验结果显示低激素水平可以促使19期精子细胞从培养的正常生精小管脱落,其中GH组（培养液中含棉酚）的变化最为明显,提示棉酚在激素作用的基础上有协同促使19期精子细胞提前脱落的效应。我们对细胞信号转导家族MAPKs的3个成员的活化形式——p-ERK、p-JNK和p-p38MAPK的表达进行检测,探索细胞信号转导分子上述改变中的作用。结果显示GH组和H组p-ERK在支持细胞的表达增加、p-p38MAPK在圆形精子细胞之间的表达增加,而p-JNK在无长形精子细胞的生精上皮中未见强阳性信号。p-ERK和p-p38MAPK在GH组和H组的表达变化分别与粘附分子N-钙粘蛋白和整合素α6的表达变化有一定相似之处,提示它们可能参与细胞粘附改变的调节,但这还需要大量实验证实。3个信号转导分子的表达在G组未出现明显改变。以上睾丸的各项实验结果中GH组的数据多与H组较为接近,并与C组间存在显著差异；另外GH组常比H组更早出现与C组间的差距,且差距也比H组大；G组的结果则多与C组相近,二者间多无显著差异。这说明联合用药在睾丸中以激素发挥主要作用,棉酚在此基础上有协同作用。二者通过促进生精细胞凋亡、影响粘附分子的表达而增加生精细胞的脱落、增加长形精子细胞提前释放或被吞噬等,最终导致睾丸的精子产量大幅度下降。在附睾中,三个实验组的精子数量和活力随用药时间增加而明显下降,10w时G组、H组和GH组附睾的精子数量分别只有C组的44.41%、40.16%和15.43%；同时,G组和H组分别只有14.00%和15.67%的可游动精子,而GH组基本未见可游动精子。另外各用药组的精子畸形率也都在不断增加,其中GH组的畸形精子出现得最早（4w）、数量也最多,10w时精子的畸形率高达91.17%,此时G组和H组的畸形率也分别达到了54.67%和63.83%。各组精子出现畸形的部位不完全相同：H组以精子头尾分离为主；而G组除了有头尾分离的精子外,尾部结构不完整（线粒体鞘不完整、轴丝脱出、尾部折断等）的精子也在不断增加；GH组的精子畸形则先以尾部异常为主,随后头尾分离的精子大量增加。各实验组均未发现头部异常的精子,附睾管上皮的形态也未发现明显改变。附睾的实验结果中GH组与C组间的差异最大,而G组和H组的数值常较为接近、并介于GH组与C组之间,提示棉酚和激素在附睾中都发挥作用、但作用的位点可能各不相同。在这两种药物的作用下,联合用药组的精子数量、形态结构和运动能力等都出现大幅度地改变。总之,无论在睾丸还是在附睾,棉酚和激素都发挥重要作用。在睾丸中以激素的作用为主、棉酚有进一步协同的效果；而在附睾中二者的作用相当。通过棉酚和激素在睾丸和附睾中的多个环节的综合作用,最终更快、更有效地降低了成熟精子的数量及其运动能力,达到比单独使用其中任何一种更好的避孕效果。本实验从形态学角度对联合用药可能在大鼠生精过程中造成的影响进行了详细、系统地观察和分析,并在此基础上从粘附分子的角度对生精细胞脱落的可能原因进行了初步探索,对信号转导分子在用药过程中的变化进行了初步检测,另外通过体外实验为体内的长形精子细胞减少的原因分析提供了参考。本实验对联合用药在大鼠生精过程中影响的具体环节以及棉酚和激素各自所起的作用进行了讨论,为联合用药的进一步深入研究提供了必要的理论依据。