白菜雄性不育相关基因BcMF15及其启动子的分离和功能验证

论文摘要

十字花科作物是我国栽培面积最大,总产量最高的一类蔬菜作物。同时它也是杂种优势利用最为广泛的一类作物,其雄性不育的选育及其应用基础的研究深受人们重视。对雄性不育机理的研究可以了解小孢子的发育机制,还可以为人工创造雄性不育系提供理论依据,在生产实践和理论上都具有十分重要的意义。本研究以白菜（Brassica campestris L.ssp.chinensis Markino）减数分裂胞质分裂突变体mmc（male meiotic cytokinesis）的野生型（可育株）花粉转录组分析中发现的基因BcMF15（Brassica campestris Male Fertility 15）为研究对象,采用RACE技术扩增分离花粉发育相关的LTP基因BcMF15的cDNA和DNA序列全长,分析其序列特征并预测其蛋白质结构和功能。采用RT-PCR分析BcMF15在白菜不同发育阶段生殖器官和营养器官中的表达状况。在此基础上构建了由组成型启动子CaMV35S（Cauliflower mosaic virus 35S）驱动的BcMF15干涉基因表达载体,通过对菜心[B.campestris L.ssp.chinensis Markino var.parachinensis（Bailey）Tsen et Lee]进行遗传转化,以获得该基因功能缺失突变体,从而分析其在花粉发育进程中的生物学功能。获得的主要研究结果如下:（1）采用RACE技术从白菜可育株中成功克隆到花粉发育相关的BcMF15（Genbank登录号:EF600901）。序列分析表明该基因cDNA序列全长768 bp,最大开放阅读框312 bp,编码了103个氨基酸,该蛋白分子重量约11.36 kDa,属于一个跨膜蛋白,具有显著的疏水区。蛋白质二级结构预测结果表明:该氨基酸序列存在6个推定的结构域:包括信号肽,跨膜域,vWF结构域,C4-锌指结构域,Trypalphaamyl结构域,AAI结构域。感兴趣的是AAI结构域包含在许多花粉发育关键的蛋白中。经GenBank数据库BLAST源性比对发现BcMF15序列与拟南芥(（Columbia）的脂质转移相似蛋白（lipid transfer protein,LTP）有88%的相似性,且具有LTP的典型结构特征。RT-PCR对其时空表达模式进行分析发现该基因在可育系的1～5级花蕾中表达,并持续表达直到嫩角果的形成,在花茎和花茎叶等孢子体组织中未检测到BcMF15的表达,而在不育系的对应组织均没有表达,因此,推测其与花粉发育密切相关。（2）根据BcMF15 DNA全长序列设计引物,运用PCR技术扩增得到十字花科6属10个物种的LTP同源序列,序列特征分析表明:不同植物物种LTP同源氨基酸序列在N端有长度为26个氨基酸残基的保守区域,而在C端则存在一定程度的变异。对LTP基因同源序列比对分析的结果表明:在核苷酸水平上的序列相似性在80%以上,氨基酸序列相似性大于53%。说明了LTPs在十字花科中相对保守。在此基础上构建其MP（The maximum parsimony）系统进化树,结果表明:芸薹属与萝卜属关系较近,其次为荠菜属、拟南芥属和山芥属,与诸葛菜属关系最远。（3）构建了BcMF15基因含有组成型启动子CaMV35S的RNA干涉载体pBD5S-RMF15,并利用农杆菌介导的方法将构建的BcMF15基因RNA干涉植物表达载体导入菜心中,获得了菜心转BcMF15干涉基因植株。（4）对BcMF15干涉载体转化获得的KanR菜心植株进行了分子、形态和细胞学的检测。利用荧光定量RT-PCR技术对前期经PCR和Southern印迹杂交检测为阳性的转pBI35S-RMF15株系,以花蕾包括小蕾,中蕾,大蕾、开放的花、嫩角果的cDNA为模板,对pBI35S-RMF15菜心转基因植株和正常植株在花粉发育的不同时期的动态表达进行了研究,结果表明:pBI35S-RMF15在各级花蕾和开放花中的表达都明显低于对照,且在中、大蕾时期降低更为显著。这说明pBI35S-RMF15干涉载体已经引发了转录后沉默效应,抑制了BcMF15基因的表达。对转化植株花器官的形态学观察发现:转化植株的雄蕊表现为花丝短小,花药不饱满、发白,花粉量少。花粉萌发试验和花粉形态电镜扫描表明,pBI35S-RMF15菜心转基因植株花粉的萌发率为35.94%,明显低于相应的空载体对照（74.40%）,存在显著差异。这表明转BcMF15干涉载体引发了RNAi沉默效应,抑制了BcMF15的表达,影响正常花粉结构的形成,从而使花粉形状发生改变,导致花粉畸形。树脂半薄切片和透射电镜相结合观察转基因植株花蕾的发育过程,发现在中蕾阶段-约小孢子发育单核靠边期,绒毡层提前降解,而使花粉发生败育。因此我们推测BcMF15编码的LTP基因作用于花药细胞中,通过影响花药在花粉发育过程中的脂质转运,并进一步调节脂质的合成和转化等代谢活动,从而影响绒毡层的发育,进而对小孢子发育过程中花粉壁的形成、花粉的萌发及花粉管的伸长产生影响。（5）利用TAIL-PCR方法首次克隆了BcMF15基因的启动子pBc15。序列分析表明,该序列A+T的比例为61.61%,C+G的比例为38.39%,符合启动子的碱基组成。对ATG上游的5’-UTR（5’-untranslated region）序列用Blast软件在GENEBANK数据库上作同源搜索发现,这段序列与大白菜（Brassica rapa subsp.pekinensis）基因组DNA的同源性为99%。使用三个重要的植物启动子顺式作用元件数据库对其中的功能元件进行分析发现:BcMF15基因的5′-UTR不仅含有启动子特有元件如TATAbox和35S启动子持有元件GATA box,而且还具有多个调控花粉发育特异表达的功能元件,如GGTT和GTGA元件以及番茄lat52/LeMAN5激活花粉特异表达的调节元件,POLLEN1LELAT52元件。此外还存在多个环境诱导的序列元件,说明了BcMF15基因的5’-UTR序列可能是一个花粉发育特异的调控序列,同时受光和干旱等胁迫因子的诱导。（6）成功构建了带有GUS报告基因的嵌合启动子载体pBI-pBc15,并通过基因枪将其转化到洋葱表皮细胞,进行瞬时表达,随后进行了X-Glue组织化学染色分析。结果表明BcMF15启动子能够激活GUS基因的表达,且融合蛋白初步定位在转化细胞的细胞核中。（7）采用浸花法（Floral Dip）成功地将BcMF15启动子表达载体转化到拟南芥中,对经过卡那抗性筛选和PCR检测的T1代拟南芥进行了GUS组织化学染色分析和花蕾GUS组织化学染色后的树脂切片观察,结果表明BcMF15启动子在拟南芥花药中特异表达。

论文目录

• 致谢
• 缩写词
• 摘要
• Abstract
• 前言
• 1 文献综述
• 1.1 植物雄性不育的研究
• 1.1.1 植物花粉发育的过程
• 1.1.1.1 花粉壁的发育
• 1.1.1.2 绒毡层的发育
• 1.1.2 花粉发育相关基因的研究
• 1.1.2.1 花药发育特异基因的克隆和表达
• 1.1.2.2 绒毡层特异性基因的克隆和表达
• 1.2 RNA干涉的研究
• 1.2.1 RNA干涉的可能机制
• 1.2.2 RNA干涉的特征
• 1.2.3 RNAi的研究策略
• 1.2.4 RNAi的应用
• 1.3 植物启动子的研究进展
• 1.3.1 启动子的类型
• 1.3.1.1 组成型启动子
• 1.3.1.2 组织特异性启动子
• 1.3.2 启动子克隆方法研究进展
• 1.3.2.1 利用启动子探针质粒载体筛选启动子
• 1.3.2.2 通过PCR技术克隆启动子
• 1.3.3 启动子功能和结构研究的策略
• 1.3.3.1 启动子顺式作用元件的电子分析
• 1.3.3.2 转化分析
• 1.3.3.3 瞬间表达分析
• 1.3.3.4 点突变分析
• 1.4 植物脂质转移蛋白研究进展
• 1.4.1 植物脂质转移蛋白的结构和分类
• 1.4.2 植物脂质转移蛋白基因的定位和表达
• 1.4.3 植物脂质转移蛋白基因启动子的分离和表达分析
• 1.4.4 植物脂质转移蛋白的生物学功能
• 1.4.4.1 抗性和防御功能
• 1.4.4.2 生殖发育方面的功能
• 1.4.4.3 LTPs与信号转导
• 1.4.4.4 LTPs的其它功能
• 1.4.5 LTPs的研究展望
• 2 脂质转移蛋白基因BcMF15的克隆及分析
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 材料与试剂
• 2.1.2 基因组DNA和总RNA的提取及反转录
• 2.1.2.1 基因组DNA提取
• 2.1.2.2 RNA的提取
• 2.1.2.3 cDNA的合成
• cDNA第一链合成
• cDNA第二链的合成
• 2.1.3 差异片段的3'RACE和5'RACE扩增
• 2.1.4 cDNA和DNA序列全长的扩增
• 2.1.5 PCR产物的克隆及测序
• 2.1.6 基因全长序列的特征分析
• 2.1.7 表达分析
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 总RNA的提取与cDNA的合成
• 2.2.2 A15T13的3'RACE扩增
• 2.2.3 A15T13的3'RACE扩增片段的测序分析
• 2.2.4 A15T13的5‘RACE扩增
• 2.2.5 A15T13的5'RACE序列分析
• 2.2.6 BcMF15 cDNA和DNA序列全长的获得
• 2.2.7 BcMF15的序列特征分析
• 2.2.8 BcMF15的表达分析
• 2.3 讨论
• 2.3.1 BcMF15属于花粉发育特异表达基因
• 2.3.2 BcMF15可能是一个新的白菜LTP基因
• 3 十字花科植物LTP基因同源序列的克隆与进化分析
• 3.1 材料和方法
• 3.1.1 植物材料
• 3.1.2 主要试剂
• 3.1.3 DNA提取
• 3.1.4 引物合成
• 3.1.5 目的基因的PCR扩增、克隆、测序和序列比较
• 3.1.6 系统树的构建
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 LTP同源基因的扩增与克隆
• 3.2.2 LTP基因同源序列比对分析
• 3.2.3 LTP基因同源序列的演化关系分析
• 3.3 讨论
• 4 BcMF15干涉表达载体的构建及对菜心的遗传转化
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 植物材料与试剂
• 4.1.2 RNAi载体构建
• 4.1.2.1 菌株与质粒
• 4.1.2.2 正义片段和反义片段的获得
• 4.1.2.3 正义片段和反义片段的制备
• 4.1.2.4 双元载体pBI121制备
• 4.1.2.5 表达质粒的构建过程
• 4.1.2.6 冻融法转化农杆菌
• 4.1.2.7 农杆菌中质粒的鉴定
• 4.1.3 表达载体对菜心的遗传转化
• 4.1.3.1 植物材料、菌株及抗生素
• 4.1.3.2 培养基
• 4.1.3.3 预培养
• 4.1.3.4 共培养
• 4.1.3.5 分化培养
• 4.1.3.6 继代及生根
• 4.1.3.7 移栽
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 BcMF15基因RNAi载体构建
• 4.2.1.1 BcME15正义片段和反义片段的获得
• 4.2.1.2 BcME15的35S-pBI121干涉载体的构建
• 4.2.1.3 农杆菌中质粒的鉴定
• 4.2.2 菜心转BcMF15干涉基因植株的获得
• 4.3 讨论
• 4.3.1 RNAi在基因功能研究中的高效性
• 4.3.2 沉默BcMF15的载体构建策略
• 5 菜心转BcMF15干涉基因植株的分子检测及功能分析
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 实验材料
• 5.1.2 转基因植株基因组DNA和总RNA的提取
• 5.1.2.1 DNA的提取
• 5.1.2.2 RNA的提取
• 5.1.3 转基因植株的PCR检测
• 5.1.4 转基因植株的Southern印迹杂交检测
• 5.1.4.1 样品处理及电泳
• 5.1.4.2 转膜
• 5.1.4.3 杂交及放射自显影
• 5.1.5 转基因植株的实时荧光定量RT-PCR检测
• 5.1.6 转基因植株的小孢子发育的形态与细胞学观察
• 5.1.6.1 试验材料
• 5.1.6.2 花粉萌发试验
• 5.1.6.3 花粉扫描电镜观察
• 5.1.6.4 花药树脂切片观察
• 5.1.6.5 花药透射电镜观察
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 菜心转基因植株的DNA提取
• 5.2.2 菜心转基因植株的PCR检测
• 5.2.3 转基因植株的Southern杂交检测
• 5.2.4 转基因菜心的实时荧光定量PCR检测
• 5.2.5 转基因植株花粉发育的形态和细胞学观察
• 5.2.5.1 花器官的形态观察
• 5.2.5.2 BcMF15菜心转基因植株的花粉萌发试验
• 5.2.5.3 花粉花药发育过程的细胞学观察
• 5.3 讨论
• 5.3.1 BcMF15干涉转化植株的细胞和分子检测
• 5.3.2 关于BcMF15的功能
• 6 BcMF15启动子的分离及序列分析
• 6.1 材料和方法
• 6.1.1 实验材料
• 6.1.2 TAIL-PCR引物
• 6.1.3 白菜总DNA的提取
• 6.1.4 TAIL-PCR扩增
• 6.1.5 目的片段的回收、克隆及重组子的筛选
• 6.1.6 BcMF15启动子序列扩增
• 6.1.7 序列分析
• 6.2 结果与分析
• 6.2.1 TAIL-PCR扩增
• 6.2.2 BcMF15启动子序列全长扩增
• 6.2.3 启动子序列分析
• 6.3 讨论
• 6.3.1 TAIL-PCR方法克隆未知启动子序列
• 6.3.2 BcMF15启动子序列特征及功能元件分析
• 7 BcMF15启动子的功能分析
• 7.1 材料与方法
• 7.1.1 试验材料
• 7.1.2 启动子载体片段的克隆
• 7.1.3 启动子表达载体的构建
• 7.1.4 基因枪介导的瞬时表达
• 7.1.4.1 洋葱表皮细胞的准备
• 7.1.4.2 质粒DNA的纯化和金粉包埋
• 7.1.4.3 用基因枪法在洋葱表皮细胞中导入外源质粒
• 7.1.4.4 融合蛋白亚细胞定位的显微镜观察
• 7.1.4.5 转化材料的X-Gluc组织化学染色检测
• 7.1.5 表达载体对拟南芥的转化分析
• 7.1.5.1 拟南芥的培养
• 7.1.5.2 浸花法转化拟南芥
• 7.1.5.3 转基因拟南芥的Km筛选和PCR检测
• 7.1.5.4 转化植株的GUS检测
• 7.1.5.5 花蕾GUS组织染色后的树脂切片观察
• 7.2 结果与分析
• 7.2.1 启动子驱动的GUS基因植物表达载体构建
• 7.2.1.1 载体片段扩增测序结果
• 7.2.1.2 启动子载体的酶切鉴定
• 7.2.1.3 农杆菌中质粒的鉴定
• 7.2.2 瞬时表达及融合蛋白的表达检测
• 7.2.3 稳定表达系统研究启动子活性及特异性
• 7.2.3.1 拟南芥转化植株的获得
• 7.2.3.2 转基因拟南芥的PCR检测
• 7.2.3.3 转化植株的GUS检测
• 7.2.3.4 花蕾GUS染色后的树脂切片观察
• 7.3 讨论
• 7.3.1 基因枪介导的瞬时表达体系中参数的选择
• 7.3.2 启动子载体对拟南芥的转化及表达分析
• 7.3.3 LTP基因与花粉发育
• 结论
• 参考文献
• 攻读博士学位期间发表的论文