VI型分泌系统在植物青枯菌致病和蛋白分泌中的作用研究

论文摘要

VI型分泌系统（type VI secretion system, T6SS）是革兰氏阴性细菌中新近发现的分泌系统,研究表明具有VI型分泌系统的细菌对人类和动物的健康构成严重的威胁。开展植物病原细菌VI型分泌系统的研究,对于探索VI型分泌系统在植物病原细菌致病机理中的作用具有非常重要的意义。首先对实验室前期构建的青枯菌3号小种Po41转座子Tn5插入突变体库进行筛选,寻找致病力减弱的突变体,同时对VI型分泌系统的8个基因进行克隆及序列分析,构建VI型分泌系统编码基因突变体,通过分析突变体致病力及蛋白泌出的变化,研究VI型分泌系统在青枯菌致病过程中的作用。1.青枯菌突变菌株Tn5插入位点分析分析了Po41菌株突变体库中Tn5的插入位点,明确了Tn5的插入位置。2.青枯菌突变株致病力分析对青枯菌3号小种Po41转座子Tn5突变体库中蛋白泌出减少的25株突变株进行了致病力测试,发现了致病力减弱的突变株PM2594。突变株PM2594在番茄根部定殖和扩展能力的研究表明,在接种后第三天,突变株PM2594在每克根内的细菌数量仅相当于野生型菌株Po41的1/50。根部扩展能力研究表明,突变株PM2594在接种点1 cm茎段处的细菌数量仅为野生型菌株Po41的1/10。表明突变株PM2594被插入基因的功能可能与青枯菌在寄主植物体内的增殖、移动及致病力相关。3.青枯菌imp基因的致病力分析在突变株PM2594中,Tn5插入到PM2594的Rsp1610开放阅读框中。Tn5的插入导致了该基因的失活,命名开放阅读框Rsp1610为imp（impaired motility and proliferation）。随后对imp在寄主范围最广的青枯菌1号小种GMI1000中的功能进行了验证,构建了GMI1000 imp基因缺失突变株。接种番茄实验显示,野生型菌株接种7天开始发病,突变菌株在接种第10天才出现症状。接种后11天,当野生型菌株的病情指数达到92时,突变株的病情指数为27,表明imp基因在GMI1000中同样与青枯菌的致病力相关。4.青枯菌VI型分泌系统编码基因簇基因克隆及功能分析克隆了植物青枯菌1号小种GMI1000 VI型分泌系统基因簇的8个基因,构建了8个基因的重组自杀质粒,获得了VI型分泌系统基因簇中的vasK基因插入突变株。接种番茄结果显示,该突变株的致病性较野生型明显下降,野生型菌株GMI1000的发病程度显著高于突变菌株GMI1000-m,其中发病后第27天的差异达极显著水平。证明VI型分泌系统vasK基因在青枯菌致病过程中起着至关重要的作用。5.青枯菌vasK基因缺失突变株泌出蛋白的双向电泳及质谱分析利用双向电泳和质谱技术分析了vasK突变体和野生型菌株GMI1000的泌出蛋白,共获得38个差异蛋白点。在GMI1000中特异性表达的蛋白差异点有15个;在vasK突变体中特异性表达的蛋白点有10个;在GMI1000中上调表达的蛋白点有3个;在vasK突变体中下调表达的蛋白点有10个。其中蛋白点592是VI型分泌系统组成表达蛋白,与野生型GMI1000相比,其在vasK突变体中的表达量下调了2/3以上,由此说明,vasK基因的缺失不仅与青枯菌的致病力密切相关,而且对泌出蛋白的种类和数量均产生了重要的影响。其中多数蛋白的功能尚不明确,这些蛋白的结构和功能将有待于进一步的研究。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 引言
• 1.1 植物细菌性青枯病
• 1.1.1 特点及危害
• 1.1.2 侵染过程
• 1.1.3 分泌的毒性因子
• 1.1.4 扩展与定殖能力
• 1.2 病原细菌的分泌系统
• 1.2.1 I 型分泌系统
• 1.2.2 II 型分泌系统
• 1.2.3 III 型分泌系统
• 1.2.4 IV 型分泌系统
• 1.2.5 V 型分泌系统
• 1.3 新型的分泌系统—VI 型分泌系统的发现
• 1.3.1 VI 型分泌系统与革兰氏阴性病原菌致病性的关系
• 1.3.2 VI 型分泌系统的作用机制
• 1.4 本论文研究的目的和意义
• 第二章 青枯菌突变体库 Tn5 插入位点分析
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 主要试剂
• 2.1.2 菌株和质粒
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 青枯菌突变株DNA 提取
• 2.2.2 Tn5 插入点右侧序列的PCR 扩增
• 2.2.3 TAIL-PCR 扩增产物的回收
• 2.2.4 TAIL-PCR 扩增的基因片段与 pGEM-T 载体的连接
• 2.2.5 重组质粒转化大肠杆菌
• 2.2.6 重组质粒的提取
• 2.2.7 重组质粒的酶切鉴定
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 TAIL-PCR 扩增结果及酶切鉴定
• 2.3.2 Tn5 插入基因位置的生物信息学分析
• 2.4 讨论
• 第三章 青枯菌突变株致病力的分析
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 菌株和质粒
• 3.1.2 主要试剂
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 青枯菌 3 号小种 Po41 与 Po41 突变体库中胞外蛋白突变株致病力的测定
• 3.2.2 青枯菌胞外蛋白缺失突变株PM2594 在根部定殖及扩展能力的研究
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 青枯菌 Po41 突变体库中胞外蛋白缺失突变株致病力的测定
• 3.3.2 马铃薯青枯菌 Po41 与 PM2594 在植株根部定殖及向上扩展菌量的比较
• 3.4 讨论
• 第四章 青枯菌imp 基因的功能分析
• 4.1 实验材料
• 4.1.1 菌株和质粒
• 4.1.2 主要试剂
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 imp 基因在 GMI1000 中的功能验证
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 imp 基因突变株的构建
• 4.3.2 imp 基因突变株的致病性测定
• 4.4 讨论
• 第五章 青枯菌 VI 型分泌系统基因克隆、vasK 突变株的构建及致病力分析.
• 5.1 实验材料
• 5.1.1 菌株和质粒
• 5.1.2 主要试剂
• 5.2 实验方法
• 5.2.1 VI 型分泌系统8 个基因的PCR 扩增
• 5.2.2 庆大霉素基因的PCR 扩增
• 5.2.3 基因重组自杀质粒的构建及鉴定
• 5.2.4 青枯菌 GMI1000 感受态细胞的制备及电转化
• 5.2.5 基因突变菌株的筛选与鉴定
• 5.2.6 突变菌株和野生型菌株致病性的测定
• 5.2.7 基因突变菌株的互补菌株构建
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 VI 型分泌系统基因簇中8 个基因的克隆
• 5.3.2 庆大霉素基因的克隆及8 个基因重组质粒的构建及鉴定
• 5.3.3 8 个基因对应的自杀质粒的构建及鉴定
• 5.3.4 vasK 基因突变菌株的筛选与鉴定
• 5.3.5 vasK 基因互补菌株的制备
• 5.3.6 突变菌株和野生型菌株致病性的测定
• 5.4 讨论
• 第六章 青枯菌vasK 基因突变体泌出蛋白的双向电泳及质谱分析
• 6.1 实验材料
• 6.1.1 菌株和质粒
• 6.1.2 生化试剂
• 6.2 实验方法
• 6.2.1 蛋白提取
• 6.2.2 蛋白定量
• 6.2.3 SDS-PAGE 电泳
• 6.2.4 双向电泳
• 6.2.5 差异蛋白的质谱分析
• 6.3 结果与分析
• 6.3.1 泌出蛋白的SDS-PAGE 分析
• 6.3.2. 泌出蛋白的双向电泳分析
• 6.3.3 泌出蛋白的质谱鉴定
• 6.4 讨论
• 6.4.1 泌出蛋白 SDS-PAGE 分析
• 6.4.2 泌出蛋白双向电泳和质谱鉴定
• 第七章 全文结论
• 一、确定了青枯菌突变体库Tn5 插入位点
• 二、筛选获得了与青枯菌致病力相关的突变株
• 三、明确了青枯菌imp 基因与致病力的关系
• 四、发现VI 型分泌系统编码基因vasK 与青枯菌的致病性密切相关
• 五、通过双向电泳及质谱分析明确了vasK 基因缺失对青枯菌蛋白泌出的影响
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 作者简介