棉花蔗糖合成酶基因（Sucrose Synthase 3）启动子结构、功能及其调控分析

论文摘要

棉花是一种种植非常广泛的重要经济作物,它主要提供天然的纺织纤维。棉纤维是一个单细胞体,因此可作为研究细胞伸长、细胞壁和纤维素合成的一个模式系统。其发育过程可分为4个相互交迭的阶段:起始、伸长、次生壁形成、成熟,由此得到成熟的棉纤维。棉花在开花时,大约有15-25%的胚珠表皮层细胞可分化发育成长绒纤维细胞。至今,人们对棉花纤维细胞起始的分子机制还了解的很少。棉花蔗糖合成酶（SuSy）是近十年的研究所发现的一系列在棉纤维起始阶段起调控作用的功能基因之一。SuSy催化蔗糖分解为果糖和UDP-葡萄糖,为纤维素的合成提供底物。研究者发现SuSy促进棉纤维细胞的分化与伸长,同时SuSy在棉纤维细胞的起始和伸长等一系列活动中起着至关重要的作用,以RNA干扰的方式抑制该基因的表达后会使转基因棉花出现无毛的表型。研究与棉纤维发育相关基因的启动子元件及调节这些基因表达的转录因子有助于了解棉花纤维起始和发育相关的分子机制。拟南芥从结构和遗传学来看,它与棉花纤维有一定的相似性。拟南芥的转基因技术成熟,效率相对较高,且生长周期短,一般2-3个月即可完成一代。因此,本研究利用拟南芥来进行棉花SuSy启动子及相关调控的研究。结果如下:1.根据Genbank中SuSy的cDNA序列（U73588）获得了该基因的基因组DNA全长序列,与拟南芥中的蔗糖合成酶家族进行比较分析后发现,棉花SuSy与拟南芥中的AtSus1和AtSus4在基因的结构及外显子的长度上都有非常高的相似性;2.经过三次基因组步移后,成功获得了长为1554bp的SuSy基因5′上游序列,同时分离出了SuSy编码区的第一个内含子,构建了启动子不用长度的5′端缺失载体及内含子相关的载体,通过农杆菌介导转化野生型拟南芥,经过筛选后获得可以稳定遗传的各载体转基因拟南芥株系;3.棉花SuSy启动子可以驱动GUS基因在转基因拟南芥的维管组织、毛刺、子叶、根、根毛以及花器官中表达。-554bp到-1554bp之间的片段对启动子的活性有非常明显的增强作用,可以达到20倍以上;4.赤霉素只对1152bp的启动子片段有调控作用,可以提高2.5倍GUS的活性,但对全长及810bp以内的启动子片段没有调控作用;5.启动子-296到-376之间的80bp片段对SuSy启动子在拟南芥毛刺中的活性起着决定作用,同时也对其在花粉中的活性有一定的影响;6.启动子上-96bp处有一个W-box序列,将该序列突变后并不影响启动子的组织特异性,但可以降低启动子的活性为原来的1/3:7.棉花SuSy基因编码区的第一个内含子在与其启动子协同下可以特异抑制GUS基因在花粉中表达,并且在其他组织中降低GUS的活性,这种抑制作用可以达到一个数量级;8.以赤霉素对内含子相关的转基因拟南芥进行处理,可以使GUS的活性提高4倍,这种增强作用可能与内含子上的P-box有关。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 前言
• 1 棉花纤维发育相关基因的研究进展
• 1.1 概况
• 1.2 与棉纤维起始有关的基因
• 1.3 与棉纤维伸长相关的基因
• 1.4 棉纤维与拟南芥毛刺
• 1.4.1 MYB类转录因子
• 1.4.2 其他毛刺相关基因
• 1.5 赤霉素对棉花纤维细胞发育的影响
• 2 高等植物内含子对基因表达调控
• 2.1 内含子影响基因表达模式
• 2.2 内含子增强基因表达
• 2.3 内含子驱动基因表达
• 2.4 内含子调控基因表达机制研究展望
• 3 研究的目的意义
• 4 技术路线
• 材料和方法
• 1 材料
• 2 方法
• 2.1 SuSy基因DNA全长及启动子的克隆
• 2.1.1 CTAB-PVP法提取棉花基因组DNA
• 2.1.2 PCR扩增SuSy基因DNA片段
• 2.1.3 基因组酶切并与Cassette连接
• 2.1.4 引物设计
• 2.1.5 PCR获取SuSy基因5'上游序列
• 2.1.6 PCR产物的克隆及测序
• 2.1.7 转化
• 2.2 序列分析
• 2.3 植物表达载体构建
• 2.3.1 启动子5'缺失系列载体构建
• 2.3.2 W-box突变载体构建
• 2.3.3 内含子相关载体构建
• 2.3.3.1 带有内含子的SuSy启动子全长片段获取
• 2.3.3.2 内含子插入到pBI121
• 2.4 重组农杆菌工程菌株的获得
• 2.4.1 农杆菌GV3101感受态细胞制作
• 2.4.2 农杆菌电击转化法
• 2.4.3 重组农杆菌工程菌株鉴定
• 2.5 拟南芥转化
• 2.5.1 拟南芥培养
• 2.5.2 农杆菌介导的DIP法转化拟南芥
• 2.5.3 拟南芥种子抗性筛选及分离比例计算
• 2.5.4 转基因T2代拟南芥培养
• 2.6 GA处理转基因拟南芥
• 2.7 GUS组织化学染色分析
• 2.7.1 试剂配制
• 2.7.2 直接染色
• 2.7.3 GUS荧光测定法
• 结果与分析
• 1 棉花蔗糖合成酶基因DNA全长片段的获得及结构分析
• 2 棉花蔗糖合成酶启动子的克隆
• 2.1 棉花基因组DNA酶切
• 2.2 分离棉花蔗糖合成酶基因5'上游序列
• 3 序列分析
• 4 载体构建
• 4.1 启动子5'端缺失载体构建
• 4.2 -376到-165之间缺失载体构建
• 4.3 W-box突变载体构建
• 4.4 内含子相关载体构建
• 5 拟南芥转化及转基因植株筛选
• 6 启动子特性分析
• 6.1 启动子在拟南芥中的表达模式
• 6.2 不同长度启动子片段的表达分析
• 6.2.1 不同启动子区域对GUS表达组织特异性的影响
• 6.2.2 不同启动子区段对GUS活性的影响
• 6.3 赤霉素对启动子活性的调控作用
• 6.4 毛刺及花粉特异表达区域分析
• 6.5 -96bp处W-box对启动子活性的影响
• 6.6 启动子功能区分析
• 7 第一个内含子调控作用分析
• 7.1 内含子特异抑制基因在花粉中表达
• 7.2 内含子减弱基因的表达
• 7.3 GA通过内含子影响基因表达
• 7.4 35S启动子作用下内含子的调控作用
• 讨论
• 1 棉花SuSy基因结构、启动子克隆及活性分析
• 2 决定启动子在纤维中活性的序列
• 3 W-box在启动子中的作用
• 4 GA对SuSy表达的调控
• 5 内含子在基因表达调控中的作用
• 6 对棉花蔗糖合成酶基因表达调控的推测
• 结论
• 参考文献
• 致谢