论文摘要
生物素（vitamin H）是动物机体维持正常生理机能所必需的B族维生素之一,在畜牧业、食品及医药等领域应用广泛。我国所用的生物素大部分从美国、日本等国家进口,价格昂贵。因此,有必要进行生物素合成的研究。由于化学法生产的高污染性,利用微生物发酵生产生物素成为国际上高技术竞争的又一热点。而枯草芽孢杆菌作为一种优秀的基因工程菌成为生产生物素的首选。庚二酸是枯草芽孢杆菌生物素合成前体物之一,在发酵生产过程中通常被添加到发酵液中来提高生物素产量,但其高价格和添加带来的环境污染问题限制了它的应用,成为发酵生产生物素过程中一个亟待解决的问题。通过基因重组来提高枯草芽孢杆菌自身庚二酸的产量就成了解决这个难题的唯一出路。在庚二酸合成基因方面人们做了大量的研究,现一致认为在枯草芽孢杆菌生物素操纵子中的bioI-orf2顺反子序列与庚二酸合成密切相关。而orf3这个功能未知基因与该顺反子紧密相连,推测可能与庚二酸和生物素的转运有关。影响克隆基因表达效率的因素有2个:第一是启动子强度;第二是基因拷贝数,但由于克隆质粒在枯草芽孢杆菌中存在复制不稳定及表达外源基因效率低等现象,将外源目的基因整合到染色体上复制表达成为解决这些问题的有效策略。本研究以枯草芽孢杆菌PY79菌株为研究材料,将强麦芽糖启动子Pglv及氯霉素基因连接到bioI-orf2-orf3顺反子上游,然后通过同源重组整合到枯草芽孢杆菌染色体上。通过增加整合序列的拷贝数,最终增加庚二酸合成量。设计引物Cm-up/Cm-down和Cobio1-up/Cobio2-down,分别以质粒pGJ103和枯草芽孢杆菌168基因组DNA为模板,PCR扩增氯霉素基因（1.0 kbp）和bioI-orf2-orf3顺反子序列（2.8 kbp）,纯化的PCR产物分别克隆入pGEM-T和pBluskm载体中产生质粒pLHX1和pLHX2。然后将pLHX2中的EcoRI-XbaI限制性内切酶片段（bioI-orf2-orf3,2.8 kbp）与pGJ113中的ApaI-EcoRI片段（Pglv,300 bp）相连接并克隆入pGEM-T载体中相应的酶切位点,产生pYG57。将pLHX1中氯霉素基因片段连入pE3载体中产生pLHX5。最后将pYG57中XbaI-ApaI片段（Pglv-bioI-orf2-orf3）插入pLHX5中产生整合载体pLHX8。所有的连接产物都以电转化转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中扩增。由于pLHX8中的bioI-orf2-orf3序列与枯草芽孢杆菌PY79基因组生物素操纵子序列同源,通过单交叉整合方式将pLHX8滚环式带入PY79染色体,形成BpLHX8。PCR初筛,正确整合子通过高氯霉素抗性（50μg/ml）扩增整合序列拷贝数,通过Southern blotting可检测到45个拷贝数。通过反相高效液相色谱法测定了发酵液体中庚二酸和生物素的的含量。试验结果表明,将Pglv-bioI-orf2-orf3顺反子序列整合到宿主菌染色体,通过氯霉素抗性提高整合序列拷贝数以及麦芽糖诱导表达,提高了庚二酸基因的合成效率,验证了bioI-orf2-orf3顺反子序列在庚二酸合成中的重要作用。在庚二酸合成量提高的同时降低生产成本,生物素的产量也得到提高,为生物素的发酵生产建立了可行的研究路线和理论依据。