优质蓝莓转LEA基因及耐寒性分析研究

论文摘要

随着人们生活质量和生活水平的提高,人们的保健意识逐渐增强,许多外国水果备受人们的青睐,其中蓝莓更是深受欢迎。由于蓝莓鲜果价格昂贵、加工工艺不断完善,以及人们逐渐认识到蓝莓对身体健康有益,世界各地蓝莓的种植面积逐年增加。近年来,我国的蓝莓产业也逐渐受到了重视。在我国北方地区,由于冬季低温干燥,蓝莓产业的发展受到了一定限制。因此,为我国北方地区培育营养价值高、对低温耐受能力强的蓝莓新品种已迫在眉睫。本研究对我国北方地区主要蓝莓栽培品种进行了营养价值分析。同时,分别以蓝莓的茎段和叶片为外植体,建立了高效组培再生体系。通过根癌农杆菌介导法将来源于柽柳cDNA文库中的LEA基因转化至营养价值相对较高的蓝莓品种——北陆基因组中,为蓝莓品种选育开辟新的途径。具体研究结果如下：1.对供试的7个蓝莓品种分别进行了氨基酸含量、总糖含量、蛋白质含量、维生素含量及矿质元素含量的测定。结果表明,北陆各测试指标表现突出,除Vb2和钙含量位居第二外,其他测试指标均列于首位；2.以不同蓝莓品种的茎段和叶片为外植体,选择基本培养基类型,同时确定植物生长调节物质的种类和适宜浓度。结果表明,在附加玉米素（Zt）的改良WPM培养基中,各品种分化率均较高,但Zt的适宜浓度在各基因型中有所差异；3.筛选出头孢噻肟钠为蓝莓遗传转化体系的抑菌抗生素,使用浓度为250 mg·L-1；蓝莓遗传转化的选择类抗生素为卡那霉素,其使用浓度为30 mg·L-1；应用农杆菌介导法对蓝莓进行遗传转化,将抗逆LEA基因转化至北陆基因组中,并确定了最优北陆遗传转化体系为：8-10周龄不定芽的中部叶片于25±1℃条件下暗培养48h,然后将其浸泡在工程菌液（OD600=0.5）中于28℃侵染60min。侵染之后于共培养培养基中暗培养4 d,转移到延迟选择培养基上,于25±1℃条件下暗培养48 h后将叶片转移到抗性芽筛选培养基上进行选择培养,此阶段需先暗培养7 d后再转至光下培养,并每隔5-7d脱菌一次；4.利用农杆菌介导法对蓝莓进行遗传转化初步获得卡那霉素抗性植株13个,经增大选择压,排除5个假阳性株系。对剩余8个阳性株系分别进行了PCR、Southern杂交和RT-PCR检测。结果表明,LEA基因已经整合到北陆基因组中,但不同转化子拷贝数不同。经一步法RT-PCR检测2个株系为转录水平沉默,其他转化子能够正常转录；5.对8个转基因株系进行低温胁迫,分别测定了胁迫前后丙二醛（MDA）含量、相对电导率（REL）、超氧化物歧化酶（SOD）活性和过氧化物酶（POD）活性。结果表明,在未发生转录水平沉默的6个转基因株系中,胁迫后的MDA含量和REL均低于对照,SOD活性和POD活性在胁迫后均高于对照,且均存在显著差异。说明转入的LEA基因能够正常表达,并提高了转基因北陆的耐寒能力。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 绪论
• 1.1 蓝莓主要栽培种类
• 1.1.1 北高灌蓝莓
• 1.1.2 南高灌蓝莓
• 1.1.3 半高灌蓝莓
• 1.1.4 矮灌蓝莓
• 1.1.5 兔眼蓝莓
• 1.2 蓝莓营养价值和医疗保健功能
• 1.2.1 蓝莓的营养价值
• 1.2.2 蓝莓的医疗保健功能
• 1.3 蓝莓组织培养研究
• 1.4 蓝莓低温条件下的基因表达研究
• 1.5 蓝莓基因工程育种研究
• 1.6 柽柳LEA基因研究进展
• 1.7 本研究的背景和意义
• 1.8 主要研究内容和技术路线
• 1.8.1 主要研究内容
• 1.8.2 技术路线
• 2 蓝莓营养价值分析
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 仪器设备
• 2.1.3 蓝莓果实中氨基酸含量的测定
• 2.1.4 蓝莓果实中总糖含量的测定
• 2.1.5 蓝莓果实中蛋白质含量的测定
• 2.1.6 蓝莓果实中Va和Ve含量的测定
• 2.1.7 蓝莓果实中硫胺素（Vb1）含量的测定
• 2.1.8 蓝莓果实中核黄素（Vb2）含量的测定
• 2.1.9 蓝莓果实中抗坏血酸（Vc）含量的测定
• 2.1.10 蓝莓果实中烟酸（Vpp）含量的测定
• 2.1.11 蓝莓果实中矿质元素含量的测定
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 蓝莓果实中的氨基酸含量
• 2.2.2 蓝莓果实中的总糖含量
• 2.2.3 蓝莓果实中的蛋白质含量
• 2.2.4 蓝莓果实中的维生素含量
• 2.2.5 蓝莓果实中的矿质元素含量
• 3 蓝莓高频离体再生体系的建立与遗传转化研究
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 植物材料
• 3.1.2 实验试剂
• 3.1.3 植物表达载体及农杆菌菌株
• 3.1.4 初代培养
• 3.1.5 增殖培养
• 3.1.6 叶盘离体再生
• 3.1.7 不定芽生根培养
• 3.1.8 驯化移栽
• 3.1.9 北陆遗传转化体系中抑菌类抗生素的筛选
• 3.1.10 卡那霉素对北陆叶片分化的影响
• 3.1.11 北陆遗传转化体系的优化研究
• 3.1.12 统计分析
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 初代培养
• 3.2.2 增殖培养的影响因素分析
• 3.2.3 叶片诱导不定芽的影响因素
• 3.2.4 北陆不定芽的生根培养
• 3.2.5 驯化移栽
• 3.2.6 最佳抑菌抗生素及适宜浓度的确定
• 3.2.7 选择抗生素浓度的确定
• 3.2.8 遗传转化体系的优化
• 3.3 讨论
• 3.3.1 蓝莓再生体系建立的影响因素
• 3.3.2 蓝莓遗传转化体系的建立
• 4 转基因蓝莓的分子检测
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 植物材料
• 4.1.2 利用选择标记基因进行检测
• 4.1.3 转基因北陆的PCR检测
• 4.1.4 外源基因的Southern印迹杂交检测
• 4.1.5 外源基因拷贝数检测
• 4.1.6 RT-PCR检测
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 卡那抗性鉴定
• 4.2.2 转基因北陆的PCR鉴定
• 4.2.3 外源基因的Southern印迹杂交鉴定
• 4.2.4 外源基因在转基因北陆基因组中整合的拷贝数
• 4.2.5 转基因北陆的RT-PCR鉴定
• 4.3 讨论
• 4.3.1 卡那抗性的检测的必要性
• 4.3.2 DNA水平检测
• 4.3.3 外源基因的转录特性
• 5 转基因蓝莓的耐寒能力研究
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 植物材料
• 5.1.2 材料处理
• 5.1.3 丙二醛（MDA）含量测定
• 5.1.4 相对电导率（REL）测定
• 5.1.5 超氧化物歧化酶（SOD）活性测定
• 5.1.6 过氧化物酶（POD）活性测定
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 转基因北陆MDA含量比较
• 5.2.2 转基因北陆REL比较
• 5.2.3 转基因北陆SOD活性比较
• 5.2.4 转基因北陆POD活性比较
• 5.2.5 各生理指标间相关性分析
• 5.3 讨论
• 5.3.1 低温胁迫对MDA含量的影响
• 5.3.2 低温胁迫对质膜相对透性的影响
• 5.3.3 低温胁迫对抗氧化系统的影响
• 结论
• 参考文献
• 攻读学位期间发表的学术论文
• 致谢