海洋放线菌来源的化合物卡拉霉素（Kalamycin）的抗肿瘤作用和机制研究

论文摘要

海洋生态环境的特殊性决定了海洋中往往含有结构奇特、新颖的化学物质,海洋药物具有药理特异性、高活性和多样性,已成为药物研发热点领域,海洋抗肿瘤药物也是其中之一。卡拉霉素（kalamycin）来源于海洋放线菌M097的聚酮类化合物,我们实验室用体外增殖抑制试验发现了卡拉霉素（kalamycin）的抗肿瘤作用。有报道其类似物lactoquinomycin和frenolicin B是肿瘤靶点AKT抑制剂,并由此推断吡喃萘醌骨架在AKT抑制过程中发挥主要作用,我们发现虽然卡拉霉素（kalamycin）含有吡喃萘醌骨架,但是并不抑制AKT及其下游信号系统;继而对卡拉霉素（kalamycin）的体外抗肿瘤作用及其机理进行了系统的分析。采用磺酰罗丹明B（SRB）法检测卡拉霉素（kalamycin）对10株肿瘤细胞株的体外增殖抑制作用,结果表明,卡拉霉素（kalamycin）能明显抑制各种组织来源的肿瘤细胞生长,具有广泛的细胞增殖抑制作用,除对一株肺癌细胞A549抑制作用不明显外,对9株肿瘤细胞株的IC50平均值为2.5μM,并且对各个细胞株生长抑制曲线形态基本一致。采用流式细胞术证实,卡拉霉素（kalamycin）能剂量依赖地诱导结肠癌细胞HCT-116和肝癌细胞SMMC-7721发生G2/M期周期阻滞,可以诱导黑色素瘤A375细胞发生凋亡。基于前人的报道,我们用Western blot方法检测卡拉霉素（kalamycin）对AKT信号系统的影响,用量从1μM增加到16μM,AKT、mTOR和磷酸化AKT、mTOR、GSK3β的总量都没有变化;因此我们判断卡拉霉素（kalamycin）不是通过AKT系统发挥作用,而是有另外的机制。细胞凋亡和周期阻滞的很多过程是和P53相关的,我们用卡拉霉素（kalamycin）对P53野生和缺失的HCT-116细胞的增殖抑制和凋亡诱导来分析该抑制作用是否和P53相关,结果显示卡拉霉素（kalamycin）对两种细胞的生长抑制和诱导凋亡作用无明显差异,其作用和P53途径是不相关的。卡拉霉素（kalamycin）细胞增殖抑制作用的非选择性,表明该化合物是一个广谱的细胞增殖抑制剂。我们用体外酶反应实验分析了卡拉霉素（kalamycin）对拓扑酶的抑制作用,结果显示卡拉霉素（kalamycin）对Topo I没有抑制作用,在20μM时几乎完全抑制Topo II,呈现出显著的浓度依赖效应,抑制作用大约比VP16强十倍。用DNA伸展实验和Topo II介导的负超螺旋pBR322切割实验,证实卡拉霉素（kalamycin）不是DNA嵌入剂和Topo II毒剂,而是一个催化抑制剂。在体外模拟Topo II的催化反应步骤,把整个过程分解,发现卡拉霉素（kalamycin）可以抑制Topo II介导的DNA的切割,但是对再连接没有作用;卡拉霉素（kalamycin）能抑制ATP水解的作用,但是在较高剂量时抑制作用要比阳性对照弱得多。因此,卡拉霉素（kalamycin）可能主要通过抑制Topo II介导的DNA的切割发挥作用。肿瘤新血管生成是原发性肿瘤赖以发生、生长和转移的物质基础。我们用了多个新生血管生成模型对卡拉霉素（kalamycin）的抗新生血管生成作用进行了检测,发现卡拉霉素（kalamycin）对内皮细胞管腔形有抑制作用,其作用效果呈现明显的剂量依赖性。卡拉霉素（kalamycin）在对内皮细胞HMEC-1在12小时内的IC50是4.39μM ,在没有显著增殖抑制作用的剂量下,对HMEC-1管腔形成依然具有抑制作用,提示卡拉霉素（kalamycin）的抗新生血管生成作用并非完全来源于其增殖抑制作用。通过体外酶反应、western blot和双荧光素酶报告基因系统分析卡拉霉素（kalamycin）抑制肿瘤新血管生成的信号途径,结果发现这种抑制作用不是依赖于酪氨酸激酶和HIF-lα途径的。综上所述,卡拉霉素（kalamycin）不是一个AKT抑制剂,它通过专一性的抑制Topo II使肿瘤细胞发生周期阻滞和细胞凋亡,主要抑制Topo II介导的DNA的切割和ATP水解作用。同时卡拉霉素（kalamycin）可以抑制肿瘤血管管腔形成,抑制作用不依赖酪氨酸激酶和HIF-lα途径。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 综述
• 1 海洋药物研究领域概况
• 2 海洋抗肿瘤药物研究概况
• 3 拓扑酶抑制剂类抗肿瘤药物研究概况
• 3.1 真核生物拓扑异构酶功能与分型
• 3.2 拓扑异构酶II 抑制剂研究与应用概况
• 4 血管生成抑制剂类抗肿瘤药物研究概况
• 5 肿瘤相关的几种信号途径和调控因子
• 5.1 P13k-Akt-mTOR 途径
• 5.2 肿瘤新血管生成途径上的关键因子
• 6 卡拉霉素（kalamycin）的研究基础
• 7 研究方案
• 第二章 卡拉霉素（kalamycin）体外肿瘤细胞增殖抑制作用和抗肿瘤靶点初步分析
• 1 材料
• 1.1 试剂
• 1.2 细胞株
• 1.3 仪器和设备
• 2 方法
• 2.1 细胞培养
• 2.2 肿瘤细胞增殖抑制实验
• 2.3 流式细胞术检测周期阻滞
• 2.4 流式细胞术检测细胞凋亡
• 2.5 P53 野生和缺失的结肠癌细胞HCT-116 增殖抑制实验
• 2.6 P53 野生和缺失的结肠癌细胞HCT-116 流式细胞术检测细胞凋亡
• 2.7 Western Blot 检测卡拉霉素（kalamycin）对AKT 信号系统的影响
• 3 结果
• 3.1 卡拉霉素（kalamycin）对肿瘤细胞的体外生长抑制作用
• 3.2 卡拉霉素（kalamycin）诱导肿瘤细胞发生周期阻滞
• 3.3 卡拉霉素（kalamycin）诱导肿瘤细胞发生凋亡
• 3.4 卡拉霉素（kalamycin）对P53 野生和缺失的结肠癌HCT-116 细胞的生长抑制作用和诱导凋亡作用无明显差异
• 3.5 卡拉霉素（kalamycin）不是AKT 抑制剂
• 4 讨论
• 第三章 卡拉霉素（kalamycin）对DNA 拓扑异构酶催化活性的抑制作用
• 1 材料
• 1.1 试剂
• 1.2 仪器
• 2 方法
• 2.1 Topo I 介导的负超螺旋pBR322 解旋反应
• 2.2 Topo II 介导的kDNA 去连环反应
• 2.3 DNA 伸展实验
• 2.4 Topo II 介导的负超螺旋pBR322 切割实验
• 2.5 链转移前和链转移后Topo II介导的DNA 断裂
• 2.6 链转移前Topo II介导的DNA再连接
• 2.7 链转移后Topo II 介导的DNA 再连接
• 2.8 Topo II 介导的ATP 水解
• 3 结果
• 3.1 卡拉霉素（kalamycin）不影响Topo I 介导的负超螺旋pBR322 解旋作用
• 3.2 卡拉霉素（kalamycin）抑制Topo II 介导的kDNA 去连环作用
• 3.3 卡拉霉素（kalamycin）不是DNA 嵌入剂
• 3.4 卡拉霉素（kalamycin）并不稳定 Topo II 和 DNA 形成的可切割复合物
• 3.5 卡拉霉素（kalamycin）抑制链转移前和链转移后Topo II介导的DNA切割
• 3.6 卡拉霉素（kalamycin）不抑制链转移前和链转移后Topo II介导的DNA再连接
• 3.7 卡拉霉素（kalamycin）不抑制Topo II 介导的ATP 水解
• 4 讨论
• 第四章 卡拉霉素（kalamycin）抑制新生血管的生成
• 1 材料
• 1.1 试剂
• 1.2 细胞株和大鼠
• 1.3 仪器
• 2 方法
• 2.1 细胞培养
• 2.2 微血管内皮细胞增殖抑制实验
• 2.4 微血管内皮细胞管腔形成实验
• 2.5 大鼠动脉环微血管生成实验
• 2.6 利用ELISA 方法分析卡拉霉素（kalamycin）对不同酪氨酸激酶的作用
• 2.7 Western blot 法分析卡拉霉素（kalamycin）对HIF-1α的影响
• 2.8 双荧光素酶报告基因测试系统分析卡拉霉素（kalamycin）对HIF-1α转录活性的影响
• 3 结果
• 3.1 卡拉霉素（kalamycin）抑制微血管内皮细胞的增殖
• 3.2 卡拉霉素（kalamycin）不抑制血管微血管内皮细胞的迁移
• 3.3 卡拉霉素（kalamycin）抑制微血管内皮细胞的管腔形成
• 3.5 卡拉霉素（kalamycin）不抑制酪氨酸激酶磷酸化
• 3.6 卡拉霉素（kalamycin）不抑制HIF-1α及其下游启动子
• 4 讨论
• 结论
• 参考文献
• 博士期间发表和完成文章（专利）情况
• 致谢