人脐血间充质干细胞分离培养及向神经细胞定向诱导分化的研究

论文摘要

目的:1、探讨人脐血间充质干细胞（MSCs）体外分离培养的最佳方法。2、探讨人脐血MSCs向神经细胞定向诱导分化的最佳方案。方法:1、无菌条件下采集足月分娩和早产儿（不足37周）脐血,密度梯度离心法分离脐血单个核细胞（MNCs）,比较不同条件对脐血MSCs原代培养过程的影响:（1）培养基:L-DMEM培养基、DMEM/F12培养基和MesencultTM培养基;（2）胎龄:足月妊娠和早产儿;（3）接种密度:5×105/cm2、1×106/cm2、5×106/cm2、1×107/cm2;（4）首次换液时间:2、3、4、5、6、7d。通过免疫荧光方法检测表面标记物CD29、CD34、CD44和CD90的表达情况,观察脐血MSCs的生物学特性。2、第3代脐血MSCs,胰酶消化传代,待长至约80%融合时进行诱导,分三组:（1）化学诱导剂组:3mmol/Lβ-ME+20g/L DMSO+200mmol/L BHA;（2）生长因子诱导组:20ng/ml EGF+20ng/ml bFGF;（3）丹参素+生长因子诱导组:3%香丹注射液（有效成分丹参素）+20ng/ml EGF+20ng/ml bFGF。采用免疫细胞化学方法和（或）免疫荧光方法检测诱导前后神经元特异性标志（NeuN、β-TubulinⅢ）和星形胶质细胞特异性标志GFAP表达的变化。结果:1、足月分娩脐血,采用MesencultTM培养基,以5×106/cm2的密度接种,首次换液时间为7d时,脐血MSCs原代培养成功率较高。相同培养条件下,早产儿脐血MSCs培养成功率高于足月分娩脐血。人脐血MSCs强表达CD29、CD44和CD90,不表达造血干细胞表面标志CD34。2、免疫细胞化学方法检测结果:诱导前三组脐血MSCs的NeuN、β-TubulinⅢ、GFAP表达均为阴性;化学诱导后上述三种标志物的阳性率分别为（71.6±4.6）%、（73.8±2.3）%和（12.6±2.0）%;生长因子诱导后分别为（43.6±3.9）%、（54.6±4.1）%和（31.8±5.0）%;丹参素+生长因子诱导后分别为（78.6±4.5）%、（82.6±4.3）%和（15.6±3.6）%。免疫荧光方法检测发现:诱导前三组脐血MSCsβ-TubulinⅢ表达均为阴性,诱导后三组β-TubulinⅢ的阳性率分别为（72.6±2.7）%、（54.5±1.9）%和（79.8±3.0）%。结论:1、足月妊娠脐血采用MesencultTM培养基,以5×106/cm2的密度接种,首次换液时间为7d,脐血MSCs原代培养成功率较高。相同培养条件下,早产儿脐血MSCs培养成功率高于足月分娩脐血。2、丹参素联合生长因子EGF、bFGF在体外可诱导脐血MSCs分化为神经元样细胞,诱导效果最佳。

论文目录

• 一、中文摘要
• 二、英文摘要
• 三、符号说明
• 四、论文正文
• （一） 前言
• （二） 材料和方法
• （三） 结果
• （四） 讨论
• （五） 结论
• 五、附图表
• 六、参考文献
• 七、致谢
• 八、攻读硕士期间发表的学术论著目录