ARHI基因对胰腺癌细胞体外增殖、凋亡和侵袭转移的影响及其相关机制研究

论文摘要

在西方国家,胰腺癌是恶性程度最高的肿瘤之一,其死亡率占恶性肿瘤的第4位,在我国胰腺癌的发病率居恶性肿瘤的第5～7位。研究报道其1年存活率低于20%,5年存活率仅为3%。胰腺癌的发病率与死亡率十分接近,预后非常差。因此应加强胰腺癌基因和分子水平的研究,期望从中发现胰腺癌诊断与治疗的有益线索,提高胰腺癌的诊治水平。现有资料表明,胰腺癌的发生是多基因参与、多阶段累积渐进的复杂过程。癌基因激活和抑癌基因失活是肿瘤发生最基本的分子事件,这会导致细胞生长失控而发生癌变。在细胞癌变过程中,经常出现一个或多个抑癌基因的缺失,表明抑癌基因的失活参与了胰腺癌的发生。ARHI是母源性印迹的抑癌基因,属于Ras超家族中的一员,但与Ras不同,具有抑癌作用。ARHI基因最早发现于妇科肿瘤,研究也最多,是与乳腺癌及卵巢癌相关的抑癌基因。由于在正常胰腺表达仅次于卵巢,我们实验室自2000年开始对ARHI在胰腺癌中的作用进行了研究。前期研究结果表明ARHI基因在正常胰腺组织广泛表达,在胰腺癌组织（47.8%）和细胞（8/8）中表达下调或缺失。将ARHI基因转染导入该基因表达缺失的胰腺癌细胞,可以诱导胰腺癌细胞凋亡,其作用可抑制RAS/MAPK信号通路,降低STAT3的活性。我们提出:ARHI基因可能是胰腺癌发生发展过程中的候选抑癌基因的假设。为了进一步证实我们的假设,并且为深入了解ARHI基因在胰腺癌发生发展过程中的作用,本研究将在上述研究基础之上,对ARHI进行了较系统研究。本研究目的是:首次通过建立ARHI基因和空载体稳定表达的胰腺癌细胞株,观察了ARHI基因对胰腺癌细胞增殖和凋亡的影响;研究了ARHI基因转染对胰腺癌细胞周期调控的影响,并首先详细探索了影响胰腺癌细胞周期的作用机制;第一次初探了ARHI基因转染后对胰腺癌侵袭转移的影响及相关蛋白的调节机制。确证ARHI基因对胰腺癌恶性表型的部分抑制功能,进一步验证ARHI基因为胰腺癌的抑癌基因。本研究论文在上述研究基础上,从增殖、凋亡和侵袭转移三个方面研究了ARHI基因在胰腺癌细胞中的作用。第一部分:ARHI在胰腺癌中的抑癌作用及其对PI3K/AKT信号通路的影响以ARHI基因稳定表达的PANC-1、MiaPaCa-2细胞株进行以下研究:方法:1)应用脂质体转染和G418筛选的方法建立了ARHI基因稳定表达的PANC-1、MiaPaCa-2细胞株,并通过RT-PCR和Western blot方法验证ARHI在稳定细胞株中基因和蛋白表达。2)通过生长曲线和MTT方法分析ARHI基因对胰腺癌细胞增殖的影响。3)流式细胞仪PI染色检测ARHI基因对胰腺癌细胞凋亡影响。4)采用Western blot方法检测了ARHI基因对PI3K/AKT信号转导通路和死亡相关蛋白激酶1（DAPK1）的影响。研究结果显示:1)ARHI基因稳定表达的PANC-1、MiaPaCa-2细胞株有ARHI蛋白和mRNA的表达,而空质粒转染组无ARHI mRNA和蛋白表达。2)在ARHI组,细胞生长速度要比空载体组明显减慢,ARHI抑制了胰腺癌细胞的生长,在3～5天,与空载体组比较,具有明显的差异性(P*＜0.05和P**88＜0.01),尤其在第5天时,抑制作用最强,对PANC-1细胞而言,空载体组细胞数增长了8.5倍,ARHI组只增长了2.8倍。同样,从MiaPaCa-2细胞的生长曲线数据分析,ARHI同样可以明显的抑制细胞的生长。3)在ARHI组,PANC-1、MiaPaCa-2凋亡细胞的百分率分别为32.9%和39.5%,对应空载体细胞分别为13.8%和15.2%,与空载体组比较,ARHI明显增加细胞凋亡百分率（P＜0.05）。4)在ARHI组,DAPK1 mRNA和蛋白表达均比空载体和无转染组明显上调。5)与空载体比较,ARHI蛋白表达后显著下调PI3K/AKT信号通路中p-AKT蛋白的表达。小结:通过建立ARHI基因稳定表达的PANC-1、MiaPaCa-2细胞株,发现:1)ARHI抑制胰腺癌细胞的生长。2)ARHI诱导胰腺癌细胞发生凋亡。3)ARHI基因可能通过影响胰腺癌细胞DAPK1蛋白,改变了胰腺癌细胞的凋亡机制。4)降低p-AKT蛋白的表达,下调与肿瘤发生相关的PI3K/AKT信号传导通路。5)前期的工作和本实验表明ARHI基因在胰腺癌发生发展过程中是一个抑癌基因。第二部分:抑癌基因ARHI对胰腺癌细胞周期停滞作用机制的研究方法:1)流式细胞仪PI染色方法检测APHI基因和空载体对胰腺癌细胞株细胞周期的影响。2)通过Western blot检测了p-AKT、AKT和MDM2蛋白的表达。3)通过Western blot技术检测了与细胞周期负调控相关的蛋白表达(包括p53、p21WAF1、p27KIP1和正调控相关的蛋白表达（包括cyclinA-Cdk2,cyclinE-Cdk2和cyclinD1-Cdk4）。4)应用PI3K/AKT的抑制剂LY294002干预ARHI表达的细胞株,检测了上述蛋白的表达。研究结果显示:1)ARHI基因可显著影响胰腺癌细胞株的细胞周期,表现为G1期的增加和S期的减少,PANC-1细胞G1期百分数由空载体的56%上升到ARHI组的75%,MiaPaCa-2细胞由54%上升到67%,ARHI组和空载体组比较,有统计学差异（P＜0.05）。2)与转染空载体相比,转染ARHI基因的细胞,在p-AKT、MDM2蛋白下调的同时,p53、p21WAF1蛋白的表达明显上调。应用LY294002处理ARHI转染的细胞后,p53,p21WAF1蛋白上调,而ARHI蛋白的表达没有变化。3)ARHI表达的细胞株中,p27kip1蛋白表达要比空载体和对照组明显上调,同时应用PI3K/AKT的抑制剂LY294002也可以导致p27kip1蛋白表达上调。4)与空载体组相比,在ARHI转染的细胞中cyclinA,D1和Cdk2,4的蛋白表达下调,cyclin E水平无变化。应用PI3K/AKT的抑制剂LY294002处理ARHI表达的PANC-1细胞12小时后,cyclinA,D1和Cdk2,4蛋白水平没有变化。小结:转染ARHI基因后,细胞周期停滞在G1期,一方面是ARHI抑制了PI3K/AKT/MDM2信号通路,诱导p53和CDK抑制因子CKIs p21WAF1和p27kip1表达上调,负向调控CDKs的活性引起的,另一方面几种细胞周期正调控蛋白cyclinA,D1和Cdk2,4的表达下调也参与了G1期的停滞。第三部分:ARHI基因对胰腺癌细胞体外侵袭转移作用的初步探索方法:1)应用细胞划痕和Transwell小室迁移方法研究了ARHI基因对胰腺癌细胞迁移的影响。2)通过Transwell小室侵袭实验观察了ARHI基因对胰腺癌细胞侵袭的影响。3)采用Pull-Down实验研究了ARHI基因对Ras和RhoA活性的改变。研究结果显示:1)细胞划痕实验结果表明,在ARHI组,细胞迁移速率比空载体组减慢,有统计学差异（P＜0.05）。2)在12h时,PANC-1和MiaPaCa-2细胞在ARHI组的迁移率分别为（13.23±3.44）%和（14.02±2.08）%,Vector组对应的迁移率分别为（19.54±3.19）%和（21.50±2.41）%,两组统计学差异显著（P＜0.05或P＜0.01）。3)表达ARHI基因的PANC-1和MiaPaCa-2细胞的侵袭率分别为（8.47±1.74）%和（7.78±0.70）%,在相同时间内明显低于空载体侵袭率（分别为（11.58±1.76）%和（10.43±1.14）%）,统计学差异显著（P＜0.05或P＜0.01）。4)转入ARHI基因后,Ras-GTP活性降低,RhoA-GTP活性没有改变。小结:1)ARHI基因可以抑制胰腺癌细胞的侵袭和转移。2)ARHI基因降低了Ras-GTP活性。3)ARHI发挥抑制细胞侵袭迁移的作用可能与Ras-RhoA无关。结论:1)ARHI抑制胰腺癌细胞的增殖和诱导凋亡。2)ARHI基因使细胞周期停滞在G1期,一方面是ARHI抑制了PI3K/AKT/MDM2信号通路,诱导p53和CDK抑制因子CKIs p21WAF1和p27kip1表达上调,负向调控CDKs的活性引起的,另一方面几种细胞周期正调控蛋白cyclin A,D1和Cdk2,4的表达下调也参与了G1期的停滞。3)ARHI基因可以抑制胰腺癌细胞的侵袭转移。该抑制作用可能与Ras-RhoA通路无关。4)ARHI基因可以部分抑制胰腺癌细胞恶性表型,进一步验证了ARHI为胰腺癌的抑癌基因。5)ARHI可能是与胰腺癌相关的调节因子,可能在胰腺癌的发生发展中起了重要的作用。

论文目录

• 缩略词表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一部分 ARHI在胰腺癌中的抑癌作用及其对 PI-3K/AKT信号通路的影响
• 实验材料
• 实验技术路线
• 实验方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第二部分 抑癌基因 ARHI对胰腺癌细胞周期停滞作用机制的研究
• 实验材料
• 实验技术路线
• 实验方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第三部分 ARHI基因对胰腺癌细胞侵袭转移作用的初步探索
• 实验材料
• 实验技术路线
• 实验方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 综述
• 参考文献
• 致谢