α-半乳糖苷酶碳源诱导机制研究及复合酶制剂的开发

论文摘要

α-半乳糖苷酶（a-D-galactoside galctohydrolases,EC3.2.1.22）属于外切糖苷水解酶（exo-glycosidase）的一种,分属于糖苷水解酶中GH4、GH27、GH36、GH57和GH97等多个家族。该酶广泛的存在于微生物、植物和动物中,可特异性水解半乳糖残基的非还原性末端α-1→6半乳糖苷键。20世纪70年代起,我国开始对该酶的开发利用进行研究,该酶被认为是食品工业、轻工业、饲料工业、制药业中最具有应用潜力的酶制剂之一。本文从α-半乳糖苷酶高产菌种选育出发,探讨产α-半乳糖苷酶的碳源诱导机制,优化其固体发酵条件及培养基组成,在此基础上以廉价的农产品加工副产物为培养基开发“以α-半乳糖苷酶为标志”的饲用复合酶制剂。论文的主要研究结果如下：实验采用X-a-Gal初筛、液体摇瓶复筛并进一步考察固体发酵能力,从实验室保存菌株及传统发酵豆制品中筛到菌株J-08,具有良好的液体发酵（3.88U/mL）及固体发酵（57.21U/g干基）产酶能力,将其编号为zju-Y1。经形态,BIOLOG生理生化分析及18S rRNA分子鉴定后,确定该菌株为黑曲霉（Aspergillus niger）。研究多种农产品加工副产物对黑曲霉zju-Y1产α-半乳糖苷酶的影响,并通过分析各农产品加工副产物组分推测,水苏糖是黑曲霉zju-Y1产α-半乳糖苷酶最有效的诱导因子之一。进一步采用单一碳源发酵验证,确定在小分子量碳源（单/寡糖）中,水苏糖具有最显著的诱导产酶效应,而在大分子碳源中瓜尔豆胶的诱导效应最为显著。采用实时荧光定量PCR技术对不同碳源诱导下黑曲霉zju-Y1三个α-半乳糖苷酶表达基因（aglA、aglB、aglC）在转录水平上的分析可知,三个基因对碳源的诱导敏感度为aglC>aglB>aglA;碳源对基因表达上调程度的影响为：水苏糖>瓜尔豆胶>半乳糖>葡萄糖。进一步对黑曲霉zju-Y1生物质降解酶调控因子转录表达水平分析认为,转录激活因子XlnR及AmyR对α-半乳糖苷酶表达基因可能存在调控作用。通过单因素实验确定采用250mL三角瓶固体发酵黑曲霉zju-Y1生产α-半乳糖苷酶的最优发酵条件为发酵温度为28℃,培养基初始水分含量为60%,初始pH为5.5,接种量12%,载曲量为25g（湿基）。以农产品加工副产物（豆粕、麸皮）为主添加少量诱导物作为培养固体基质,经响应面优化后得到最佳培养基组成为（g/10g干基）：豆粕粉1.3782g,麸皮8.0916g,瓜尔豆胶0.4802g, KH2PO40.01g, MnSO4·H2O0.04g。用此培养基发酵96h后最大酶活为265.934U/g干基。实验表明黑曲霉zju-Y1具有强大的水解酶酶系,在纤维素酶、α-淀粉酶、果胶酶和酸性蛋白酶等方面均有良好的产酶能力。本文在优化的α-半乳糖苷酶固体培养基为基础上,采用响应面分析方法分别建立纤维素酶、α-淀粉酶、果胶酶和酸性蛋白酶培养基组成与酶活响应值得函数模型。分别设计家禽/畜用复合酶复配比例,应用穷举法数值计算,获得满足设计的培养基组成。通过黑曲霉ziu-Y1单一菌种一次发酵,获得“以α-半乳糖苷酶为标志”的家禽用复合酶制剂A,其组成为α-半乳糖苷酶243.67U/g干基,纤维素酶431.62U/g干基,α-淀粉酶339.77U/g干基,果胶酶382.19U/g干基,酸性蛋白酶为3689.16U/g干基；以及家畜用复合酶制剂B,其组成为α-半乳糖苷酶235.66U/g干基,纤维素酶428.17U/g干基,α-淀粉酶362.73U/g干基,果胶酶359.21U/g干基,酸性蛋白酶为3614.25U/g干基。分析复合酶制剂的酶学性质可知,以黑曲霉zju-Y1为菌株开发的复合酶制剂中各酶在40℃-60℃的反应温度范围和pH3.0-7.0范围内偏酸性环境中内均能保证较好的酶活力以及稳定性。经家禽/家畜的体外模拟消化试验后,复合酶制剂可有效提高饲料消化率,与a-半乳糖苷酶单酶添加相比较,对寡糖的降解更具优势。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 目录
• 名词缩写表
• 第一章 绪论
• 1.1 酶制剂概况
• 1.1.1 国内外酶制剂的研究动态
• 1.1.2 抗营养因子
• 1.2 α-半乳糖苷酶的研究进展
• 1.2.1 α-半乳糖苷酶的来源
• 1.2.2 α-半乳糖苷酶的酶学特性
• 1.2.3 α-半乳糖苷酶的应用
• 1.3 饲用酶及复合酶制剂
• 1.3.1 复合酶制剂的分类及其作用机制
• 1.3.2 复合酶制剂的生产方法
• 1.3.3 复合酶制剂在饲料中的应用及发展趋势
• 1.4 研究目的和技术路线
• 1.4.1 研究目的和意义
• 1.4.2 技术路线
• 1.4.3 研究内容
• 第二章 产α-半乳糖苷酶菌株的分离、选育及鉴定
• 2.1 材料与仪器
• 2.1.1 菌株和材料
• 2.1.2 主要仪器设备
• 2.1.3 主要试剂
• 2.1.4 培养基
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 α-半乳糖苷酶酶活测定方法
• 2.2.2 高产α-半乳糖苷酶菌株的筛选
• 2.2.3 α-半乳糖苷酶产生菌的培养条件
• 2.2.4 菌种鉴定
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 菌种分离及初筛
• 2.3.2 菌种复筛
• 2.3.3 菌种鉴定
• 2.4 小结
• 第三章 不同碳源对发酵产α-半乳糖苷酶的作用
• 3.1 材料与仪器
• 3.1.1 菌株及材料
• 3.1.2 主要仪器设备
• 3.1.3 主要试剂
• 3.1.4 培养基
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 产α-半乳糖苷酶的培养条件
• 3.2.2 α-半乳糖苷酶酶活测定方法
• 3.2.3 生物量测定方法
• 3.2.4 分泌蛋白含量测定方法
• 3.2.5 HPLC检测条件
• 3.2.6 SDS蛋白电泳方法
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 不同固体基质对α-半乳糖苷酶发酵的影响
• 3.3.2 不同碳源对α-半乳糖苷酶液体发酵的影响
• 3.4 小结
• 第四章 碳源诱导调控α-半乳糖苷酶基因表达
• 4.1 材料与仪器
• 4.1.1 菌株及材料
• 4.1.2 主要仪器设备
• 4.1.3 主要试剂
• 4.1.4 培养基
• 4.1.5 荧光定量PCR引物
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 产α-半乳糖苷酶的培养条件
• 4.2.2 α-半乳糖苷酶酶活测定方法
• 4.2.3 生物量测定方法
• 4.2.4 分泌蛋白含量测定方法
• 4.2.5 菌体的扫描电镜方法样品处理方法
• 4.2.6 SDS蛋白电泳方法
• 4.2.7 黑曲霉总RNA提取方法
• 4.2.8 逆转录方法
• 4.2.9 基因表达水平差异检测（Real-Time PCR）
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 诱导因子对酶活的影响
• 4.3.2 诱导因子对生物量及蛋白分泌的影响
• 4.3.3 诱导因子对α-半乳糖苷酶表达基因转录水平的影响
• 4.3.4 诱导因子对菌体形态的影响
• 4.3.5 调控基因的转录表达
• 4.4 小结
• 第五章 固体发酵生产α-半乳糖苷酶
• 5.1 材料与仪器
• 5.1.1 菌株及材料
• 5.1.2 主要仪器设备
• 5.1.3 主要试剂
• 5.1.4 培养基
• 5.2 实验方法
• 5.2.1 产α-半乳糖苷酶的培养条件
• 5.2.2 α-半乳糖苷酶酶活测定方法
• 5.2.3 培养基中水分含量的测定
• 5.2.4 响应面设计
• 5.2.5 α-半乳糖苷酶的分离提取
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 发酵条件对黑曲霉zju-Y1产α-半乳糖苷酶的影响
• 5.3.2 固体发酵黑曲霉zju-Y1产α-半乳糖苷酶诱导培养基的优化
• 5.3.3 α-半乳糖苷酶酶的分离提取方法的比较
• 5.4 小结
• 第六章 固体发酵生产以α-半乳糖苷酶为标志的复合酶制剂
• 6.1 材料与仪器
• 6.1.1 菌株及材料
• 6.1.2 主要仪器设备
• 6.1.3 主要试剂
• 6.1.4 培养基
• 6.2 实验方法
• 6.2.1 产α-半乳糖苷酶的培养条件
• 6.2.2 酶活测定
• 6.2.3 酶活的响应面优化
• 6.2.4 数值计算分析复合酶制剂复配培养基
• 6.3 结果与分析
• 6.3.1 纤维素酶响应面分析
• 6.3.2 α-淀粉酶响应面分析
• 6.3.3 果胶酶响应面分析
• 6.3.4 酸性蛋白酶响应面分析
• 6.3.5 复合酶制剂配伍的优化
• 6.4 小结
• 第七章 复合酶制剂酶学性质研究及体外模型降解评价
• 7.1 材料与仪器
• 7.1.1 材料
• 7.1.2 主要仪器设备
• 7.1.3 主要试剂
• 7.2 实验方法
• 7.2.1 体外模型的建立
• 7.2.2 酶活的测定
• 7.2.3 干物质消化率
• 7.2.4 还原糖测定
• 7.2.5 粗蛋白测定
• 7.2.6 HPLC检测条件
• 7.3 结果与分析
• 7.3.1 复合酶制剂的酶学性质
• 7.3.2 复合酶制剂的体外降解试验
• 7.4 小结
• 第八章 结论与展望
• 8.1 本论文主要结论
• 8.2 展望
• 参考文献
• 致谢
• 附：个人简历及攻读博士学位期间发表的论文