论文摘要
新近有研究证明，NGAL是一种新型转铁蛋白，经特异受体，介导着一条独特跨膜转铁通路。我们以往研究发现，NGAL在人食管上皮癌变中显著过表达，与癌细胞侵袭性和不良分化密切相关，但作用机制不甚明了。最近我们的研究表明，NGAL蛋白跨膜转铁通路可能存在于慢性炎症食管上皮和食管癌组织中，可被炎症因子诱导激活。推测借此会有过量铁离子涌入细胞，引发严重自由基反应与基因突变，诱导癌变，加剧癌细胞多样性生存竞争，进而演变出侵袭性更强癌细胞克隆。为了探讨NGAL蛋白在食管癌中的具体作用机制，我们分析了食管癌细胞中NGAL蛋白受体的表达并发现了一种新的NGAL蛋白受体剪接亚型NgalR-3。实验结果表明，在COS-7细胞异源表达系统中，NgalR-3蛋白与NGAL蛋白显示出相同的细胞定位模式；而免疫共沉淀实验证实，两蛋白间存在着明确的相互作用关系。这些研究提示，NgalR-3可能是NGAL蛋白的一个潜在受体，在介导食管癌细胞NGAL蛋白跨膜转铁中发挥作用。内容与方法1．通过RT-PCR技术检测NGAL基因及其受体NgalR-1／2在多个食管癌细胞系、食管癌组织和食管癌手术切缘组织中的表达情况。2．从EC18食管癌细胞中克隆NgalR基因，分析cDNA的结构特征。3．通过RT-PCR技术检测新发现的NGAL受体选择性剪接亚型NgalR-3在多个食管癌细胞系、食管癌组织、食管癌手术切缘组织以及其他正常组织中的表达情况。4．Western Blotting分析COS-7细胞中异源转染的NgalR-2与NgalR-3等选择性剪接亚型的表达情况，同时应用哺乳动物细胞免疫共沉淀技术和免疫荧光细胞分析技术，检测NGAL蛋白与其受体NgalR-2或NgalR-3在细胞内的相互作用及其细胞共定位情况。5．构建NgalR-2和NgalR-3哺乳动物细胞稳定表达载体，筛选稳定表达细胞系。结果和结论1．RT-PCR检测结果显示，食管癌细胞系EC171、EC18、EC109、EC8712，以及食管癌组织和食管癌手术切缘组织中均有NGAL及其膜受体（NgalR-1／2）的表达。提示NGAL跨膜转铁通路可能存在于食管癌组织细胞中。2．对EC18食管癌细胞中NGAL受体（NgalR）的cDNA结构进行分析，发现存在多个选择性剪接亚型。序列比对结果显示，在EC18食管癌细胞中NgalR基因mRNA除文献报道的NgalR-1和NgalR-2选择性剪接亚型（分别编码538个和520个氨基酸）外，还存在另外两个新的mRNA选择性剪接亚型NgalR-3和NgalR-4，分别编码207和88个氨基酸残基。3．RT-PCR检测结果显示，NgalR-3在多个食管癌细胞系、食管癌组织、食管癌手术切缘组织以及正常组织中均有表达。20例食管癌与切缘配对组织样本，在食管癌组织中，有14例样本NgalR-3 mRNA表达水平上调，占70％；11例样本NgalR-1／2 mRNA表达水平上调，占55％，提示NgalR-3在食管癌中所发挥作用可能更加重要。4．异源细胞表达检测证实，NgalR-2或NgalR-3蛋白分子量的大小与预测结果一致。免疫荧光细胞分析技术证实，NgalR-3蛋白与NGAL蛋白显示出相同的细胞定位模式。而免疫共沉淀实验证实，NgalR-3蛋白与NGAL蛋白间存在着相互作用。提示NgalR-3蛋白可能是NGAL蛋白的一个潜在的受体，在食管癌细胞NGAL蛋白跨膜转铁中发挥作用。5．构建了NGAL蛋白受体基因真核表达载体pcDNA-myc-NgalR2和pcDNA-myc-NgalR3，并成功转染HeLa细胞。将pcDNA3空载体以同样方法转染HeLa细胞作为阴性对照。G418筛选后获得稳定表达转染子的细胞系。这将为进一步研究NGAL蛋白介导的跨膜转铁通路提供有效的细胞模型。