黄葵黄酮类成分的吸收与代谢研究

论文摘要

黄葵又名黄蜀葵花（Abelmoschus manihot （L.） Medic）是锦葵科秋葵属中草药,该药具有抗炎、抑菌、抗凝血、抗氧化、利尿、对心肌和脑缺血损伤的保护作用,对肾细胞膜的保护作用等,在临床上常被用来治疗慢性肾炎、糖尿病肾病、口腔溃疡和烧伤等疾病。现有对黄葵化学成分和药理作用的研究,表明其中主要的化学成分是金丝桃苷、异槲皮苷、棉皮素-8-O-葡萄糖醛酸苷、杨梅素、棉皮素、槲皮素、槲皮素-3’-O-葡萄糖苷等为主的黄酮类成分。第Ⅲ类新药黄葵胶囊,不久前已获得国家食品药品监督管理局（SFDA）的审批,主要是由黄蜀葵花的醇提取物组成,广泛用于治疗慢性肾小球肾炎。截至目前,黄葵胶囊已成为我国传统中医药在治疗慢性肾炎方面发挥重要作用的常用中药。随着黄葵在临床上的广泛应用,对其体内动态过程的解析显的相当重要,为此,本论文通过建立大鼠在体肠灌流模型、肠道菌群体外代谢模型；采用微透析采样技术与UPLC-Q-TOF-MS联用分析技术、运用UPLC-Q-TOF-MS中MSE数据采集方式,以质量丢失滤过（MDF）处理为基础快速筛选和鉴定代谢物的方法,试图从中获取大量的生物信息,以明确其在体内吸收和代谢过程的特征,阐明黄葵黄酮类成分的作用机制与过程。对于指导新药设计,提高药物疗效和安全性,科学的评价黄葵黄酮类成分的药用价值奠定了基础。首先,本论文综述了黄葵化学成分、相关药理学研究、常规的吸收模型、黄酮类成分的吸收代谢研究、微透析采样技术,为黄葵黄酮类成分的吸收和代谢过程的研究奠定了基础。为了研究黄葵黄酮类成分的肠吸收机制,进行了黄葵醇提物不同浓度、不同肠段大鼠在体肠吸收的研究。采用HPLC法测定循环液中药物浓度,分析了黄葵6种黄酮类成分的肠吸收,开展了P-gp抑制剂、吸收促进剂对黄葵黄酮类成分吸收影响的研究。实验结果显示：黄葵各黄酮成分在不同浓度下,Ka值没有明显差异（P>0.05）,吸收呈一级动力学过程,提示为被动扩散吸收；各黄酮成分之间的吸收有差异性,苷类成分的Ka值小于苷元类成分；各成分在不同肠段均有吸收,金丝桃苷和杨梅素的最佳吸收部位分别为空肠和十二指肠；P-gp抑制剂维拉帕米可促进异槲皮苷、金丝桃苷、杨梅素和槲皮素3’-O-葡萄糖苷的吸收。吸收促进剂牛胆盐可显著增加异槲皮苷、棉皮素-8-葡萄糖醛酸苷、槲皮素-3’-葡萄糖苷、杨梅素和金丝桃苷的吸收,SDS可显著增加异槲皮苷、棉皮素-8-葡萄糖醛酸苷、槲皮素-3’-葡萄糖苷和金丝桃苷的吸收,卵磷脂、EDTA对黄葵各黄酮成分无显著的促吸收效果（P>0.05）。有些吸收促进剂如卵磷脂、EDTA,甚至减少各组分的吸收。上述吸收促进剂对槲皮素均无显著差异,提示槲皮素的吸收可能与上述几种促进吸收剂所介导的吸收机制无关。建立了肠道厌氧菌群体外代谢研究模型,对黄葵黄酮类成分的肠道菌群代谢进行了研究。实验结果显示：在人肠道菌孵育液中发现以下成分：金丝桃苷、异槲皮苷、棉皮素-8-0-p-D-葡萄糖醛酸苷、杨梅素、槲皮素、金丝桃苷羟基化产物、2个金丝桃苷乙酰化产物、槲皮素双羟基化产物、槲皮素甲基化结合产物、槲皮素脱氧、杨梅素的乙酰化产物。在大鼠肠道菌孵育液中发现以下成分：金丝桃苷、异槲皮苷、棉皮素-8-0-β-D-葡萄糖醛酸苷、杨梅素、槲皮素-3’-O-β-D-葡萄糖苷、槲皮素、2个金丝桃苷羟基化产物、2个金丝桃苷乙酰化产物、槲皮素甲基化结合产物、槲皮素脱氧、杨梅素的乙酰化产物。另外经研究表明主要的黄酮苷类成分均水解为相应的苷元,揭示黄葵黄酮类成分在肠道菌群中的代谢途径主要是以水解反应和羟基化等Ⅰ相代谢反应为主。通过灌胃给药,首先考察了黄葵黄酮类成分在大鼠体内的分布情况,试图寻找黄葵黄酮类成分在体内的靶向器官。实验结果表明：黄葵黄酮类各组分在大鼠体内的分布主要集中在肾、肝中,这与黄葵广泛的应用于肾病的治疗是相符的。通过微透析取样技术与UPLC-Q-TOF/MS联用分析黄葵黄酮类成分在大鼠血液和靶向器官肾脏中的代谢情况,试图寻找其存在的潜在活性成分。实验结果表明,在大鼠血液透析液中发现了：金丝桃苷、异槲皮苷、棉皮素-8-O-β-D-葡萄糖醛酸苷、杨梅素、槲皮素-3’-O-β-D-葡萄糖苷、槲皮素、槲皮素单葡萄糖醛酸苷-1和槲皮素单葡萄糖醛酸苷-2。在大鼠肾透析液中发现了：金丝桃苷、异槲皮苷、槲皮素单葡萄糖醛酸苷-2。研究表明黄蜀葵的醇提取物能够保护小鼠避免受戊四唑引起的惊厥反应并降低小鼠的死亡率；可减少小鼠游泳时不动时间,此外,通过超高效液相质谱联用技术（UPLC-MS）测定大鼠脑内黄蜀葵醇提物的潜在活性成分,结果表明其潜在活性成分主要是异槲皮苷,金丝桃苷,槲皮素-3’-O葡萄糖苷,槲皮素及三种代谢物,这些成分可能是黄蜀葵醇提物中的活性成分,并具有潜在的抗惊厥及抗抑郁作用。采用UPLC-Q-TOF-MS联用技术,通过MetabolynxTM软件中的MSE数据采集方式,以质量丢失滤过（MDF）处理为基础,研究了大鼠静脉注射金丝桃苷后金丝桃苷在血浆、尿液、胆汁中的代谢,金丝桃苷总共被检测到原型及其12个Ⅱ相代谢产物,结果表明甲基化、硫酸化、葡萄糖醛酸化是金丝桃苷在体内的主要代谢途径。在血浆中发现了：金丝桃苷的原型、3’-O-甲基-金丝桃苷；在尿液中发现了：金丝桃苷的原型、3’-O-甲基-金丝桃苷、4’-O-甲基-金丝桃苷、2个金丝桃苷的硫酸化结合产物、金丝桃苷的甲基化葡糖醛酸代谢物、金丝桃苷的硫酸化葡糖醛酸结合产物、2个金丝桃苷的甲基化硫酸结合产物。在胆汁中发现了：3’-O-甲基-金丝桃苷、4’-O-甲基-金丝桃苷、金丝桃苷的硫酸化结合产物、3个金丝桃苷的甲基化葡糖醛酸代谢物、2个金丝桃苷的甲基化硫酸结合产物、2个金丝桃苷的葡糖醛酸代谢物。这些均符合黄酮类化合物在体内的代谢规律。为金丝桃苷药效物质基础和作用机理提供依据,并有助于金丝桃苷的合理临床用药方案和质量控制提供一定的参考。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1 黄葵研究进展
• 1.1 黄葵的化学成分
• 1.2 黄葵的药理活性
• 2 黄酮类成分吸收代谢研究
• 2.1 黄酮类成分的吸收及其促吸收研究
• 2.2 黄酮类成分的代谢研究
• 3 微透析与UPLC-Q-TOF-MS联用技术
• 4 本论文的立题依据、研究目的与内容
• 参考文献
• 第二章 黄葵黄酮类成分在体肠吸收研究
• 1 材料与方法
• 2 不同浓度黄葵黄酮类成分肠吸收研究
• 3 各成分在不同肠段吸收研究
• 4 吸收促进剂对黄葵黄酮类大鼠小肠吸收影响研究
• 5 P-gp抑制剂对黄葵黄酮类大鼠小肠吸收影响研究
• 6 结论
• 参考文献
• 第三章 黄葵黄酮类成分代谢研究
• 1 黄葵黄酮类成分体外肠道菌群代谢研究
• 1.1 材料与方法
• 1.2 人肠道菌孵育液和大鼠肠道菌孵育液中代谢物鉴定分析
• 1.3 结论
• 2 黄葵黄酮类成分在体代谢研究
• 2.1 黄葵黄酮类成分在大鼠体内分布研究
• 2.2 黄葵黄酮类成分在大鼠血液与肾脏代谢研究
• 2.2.1 材料与方法
• 2.2.2 血管透析液中代谢物鉴定分析
• 2.2.3 肾透析液中代谢物鉴定分析
• 2.2.4 结论
• 3 黄葵抗惊厥、抗抑郁作用及脑内潜在效应物质研究
• 3.1 材料与方法
• 3.2 黄葵醇提取物（AMEE）对PTZ引起惊厥的抑制作用的分析
• 3.3 强制游泳实验中黄葵醇提取物（AMEE）对小鼠静止时间的影响
• 3.4 大鼠脑内黄葵醇提取物的潜在活性成分鉴别
• 3.5 结论
• 4 金丝桃苷在大鼠体内代谢研究
• 4.1 材料与方法
• 4.2 大鼠尿液、胆汁、血浆中金丝桃苷及其代谢物鉴定分析
• 4.3 结论
• 参考文献
• 结语
• 攻读硕士学位期间取得的学术成果
• 致谢