中国猪链球菌2型强致病株体内诱导表达基因的筛选研究

论文摘要

1998年及2005年分别在我国江苏省和四川省暴发的两次大规模猪链球菌2型（Streptococcus suis 2,S. suis 2）感染事件,使得猪链球菌感染作为一种严重的人兽共患病备受关注。自1968年丹麦发现第一个猪链球菌感染病人以来,世界各国报道的猪链球菌感染人数已达200多人,遍及20多个国家[1],死亡率可达20%-45%。而在1998年及2005年疫情中,感染人数达229人,病死率竟高达60%80%,并出现了“链球菌中毒性休克综合征”（Streptococcal toxic shock syndrome, STSS）这一新的临床类型[2],提示S. suis 2病原体可能较以往有了重要突变,具有了很强的致病能力及体内生存能力。但关于强致病性猪链球菌与宿主细胞相互作用进而引起疾病的具体机制,至今尚未明确。以往关于猪链球菌的研究显示:荚膜多糖（Capsular polysaccharide,CPS）、溶血素（Suilysin,SLY）、细胞外因子（Extracellular Factor,EF）、溶菌酶释放蛋白（Muramidase released protein, MRP）、粘附素（Adhesin）[3-5]等因子在细菌的致病过程中发挥着重要的作用,但这些都难以解释猪链球菌在1998年及2005年两次疫情中表现出来的不同以往的超强致病能力[6, 7]。体内诱导表达基因（in vivo induced gene,ivi gene）[8]是指一类仅在病原微生物进入宿主体内后才表达而在体外生长时不表达的独特基因。大量研究表明,ivi gene往往与病原菌在宿主体内的生存和致病密切相关,有的甚至是病原菌毒力的决定因素,在致病过程中发挥着重要作用,同时也是抗菌药物、诊断试剂、疫苗设计及研究的良好靶标。“体内诱导抗原技术”（In vivo Induced Antigen Technology, IVIAT）[9]利用已去除针对体外抗原抗体的患者恢复期血清从病原微生物基因组表达文库中筛选其ivi gene,不依赖动物模型的建立,是目前ivi gene研究的一项重要技术。本研究中,我们利用IVIAT筛选中国猪链球菌2型强毒株（05ZYH33）基因组表达文库,寻找其体内诱导基因,为深入认识其致病机理奠定基础。整个实验流程图（见图1）1.猪链球菌感染病人血清的收集与处理: 9份S.suis 2感染患者恢复期血清由唐家琪教授惠赠,9名患者均为出现典型临床症状的确诊病人,挑选效价较高的8个病人的血清,等体积混合,加入蛋白酶抑制剂。混合血清分别先用05ZYH33和BL21 （DE3）全细胞体外培养物吸附,再用两菌的超声裂解物及热变性裂解产物进行吸附,尽可能去除血清中针对体外表达抗原的抗体。每次吸附后吸取5-10ul血清,采用ELISA方法（05ZYH33菌株超声裂解产物为包被抗原）进行血清吸附效果评定。结果显示血清经多次吸附处理后抗体滴度明显下降,表明血清中含有的针对05ZYH33强致病株体外抗原的抗体越来越少,最后两次吸附后的OD值无明显下降,提示血清中针对05ZYH33株体外表达抗原的抗体已基本去尽2.基因组表达文库的构建:用pET-30 a/b/c载体表达系统构建表达文库。提取05ZYH33基因组DNA,用Sau3AⅠ进行不完全酶切,回收0.5～1.5 kb的DNA片段。纯化的DNA片段与经同尾酶BamHⅠ酶切及CIAP去磷酸化处理的pET-30 a/b/c载体连接,连接产物电转化DH5α感受态细胞,采用卡那霉素LB平板筛选阳性重组子。随机挑选部分阳性克隆提取质粒后用XhoⅠ与KpnⅠ行双酶切鉴定,结果显示插入片段大都分布在0.5～1.5kb范围之内,重组阳性率达95%,共获得阳性重组克隆约3.20×104个,远大于理论计算值,达到建库要求,表明文库构建成功。3.基因组表达文库的筛选:采用原位免疫印迹技术对表达文库进行筛选:表达文库转化菌液稀释后均匀涂布kana-LB平板（300～500个菌落/平板）,37℃培养10 h后将菌落影印至灭菌硝酸纤维素膜（NC膜）上。带菌NC膜转移至含kana和IPTG的LB平板37℃诱导培养4 h后,用氯仿蒸汽作用15 min以裂解细菌释放蛋白。NC膜用10 %脱脂奶粉封闭过夜,并依次与吸附血清和辣根过氧化酶标记的羊抗人IgG抗体,室温下反应1-2 h,用DAB显色试剂盒进行检测,显色明显高于背景者为初筛阳性克隆,以不含插入片段的pET-30 a/b/c空载体的BL21菌落为阴性对照,按初筛相同步骤进行第二次筛选,重复两遍以排除假阳性,最后确定了151个复筛阳性克隆,包含了122个可能的ivi基因。4. RT-PCR验证:将Todd-Hewitt（TH）培养基培养的猪链球菌05ZYH33株,用TRIzol提取其总RNA,用RNase-Free DNase I处理彻底消除其DNA后,用所筛选的122个ivi基因设计的特异性引物进行RT-PCR扩增验证,并设立阳性对照。凝胶电泳检测扩增结果显示,6个基因有极弱的条带,为可疑的体内诱导基因;19个基因没有相应的条带,说明其在体外是没有表达的,为体内诱导基因。综上所述,通过IVIAT技术的筛选,我们初筛出556个克隆,通过两次复筛得到151个克隆,其中包括122个可疑的ivi基因,最后通过RT-PCR验证最终鉴定出25个猪链球菌2型的ivi基因,包括5个ABC转运系统的ivi基因;2个IV型分泌系统的ivi基因;1个毒力因子ivi基因;3个核酸代谢的ivi基因;3个细胞结构合成的ivi基因;4个重要代谢途径的ivi基因;1个转座酶的ivi基因;1个DNA翻译、转录的ivi基因及5个功能未知蛋白的ivi基因。基因功能分析提示这些体内诱导表达基因可能和细菌在宿主体内的生存与致病相关,其中一部分基因还可能为重要的毒力因子或疫苗候选因子,需进一步深入研究。

论文目录

• 英文缩写一览表
• 英文摘要
• 中文摘要
• 背景
• 第一章 猪链球菌2 型强致病株基因组表达文库的构建
• 前言
• 试剂材料
• 实验方法
• 结果
• 讨论
• 第二章 血清的收集与吸附
• 前言
• 试剂材料
• 实验方法
• 结果
• 讨论
• 第三章 表达文库的筛选
• 前言
• 试剂与材料
• 实验方法
• 结果
• 讨论
• 第四章 RT-PCR 验证分析
• 前言
• 试剂与材料
• 实验方法
• 结果
• 讨论
• 全文总结
• 致谢
• 参考文献
• 文献综述 猪链球菌2 型感染的动物模型的研究进展
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间发表的文章