放线细菌新种的鉴定及砷氧化土壤杆菌特性研究

论文摘要

本论文包括两方面的研究内容：第一部分主要为一株放线细菌新种的鉴定与多项分类学研究；第二部分主要为七株砷氧化土壤杆菌特性的研究。1放线菌在医药工业、农业、环境治理等领域都有重要的地位。它在土壤中分布广泛,属于优势类群。目前,放线菌已被列为为高（G+C）mo1%的革兰氏阳性细菌。未知的放线菌数量无穷,因而,需要不断加强系统分类学的工作本研究从中国武汉采集的猪粪中分离到一株革兰氏阳性,好氧,不产孢子的放线细菌TL1。该菌株的细胞壁肽聚糖类型为meso-DAP,主要极性脂为PE,PI和DPG。细胞膜上主要呼吸醌类型为MK-8（H4）,细胞壁主要脂肪酸为（>10%）为iso-C16:0.iso-C15:0和C17：1ω8c。基因组DNA （G+C） mol%为70.9%。根据对16S rRNA基因序列系统发育学分析,结果显示菌株TL1与Knoellia sinensis （98.5%）, Knoellia subterranea （98.2%）及Knoellia aerolata （96.9%）同源性最高。菌株TL1与K. sinensis及菌株TL1与K. subterranea的DNA-DNA杂交结果分别为27.3%和34.0%。通过对菌株TL1及其关系密切的标准菌株进行表型特征、化学分类学、系统发育学各方面的综合比较,结果表明菌株TL1是Knoellia属内的一个新种,提议命名为黄色诺尔氏菌（Knoellia flava sp. nov.）,模式菌株为TL1T （= CGMCC 1.10749T=KCTC 19810T）2砷主要以亚砷酸盐(As（Ⅲ）和砷酸盐(As（V）的形式存在。As（Ⅲ）的毒性和危害性要远远大于As（V）。因此,我们可以利用砷氧化菌将As（Ⅲ）氧化为As（V）,从而降低其对人类的危害。近几年,本课题组研究发现,在不同砷污染环境中分离得到的砷氧化菌以土壤杆菌属（Agrobacterium）为主。本论文主要是对不同来源的七株砷氧化土壤杆菌的各种特性展开了一系列的研究工作,以确定砷氧化土壤杆菌的砷氧化特性,生理生化特性及其与环境相关的特性和共性,从而为砷污染的生物修复提供一定的理论基础。首先,对这七株菌进行了一系列菌种鉴定的工作。根据对16S rRNA基因序列系统发育学分析,结果显示这七株菌株与土壤杆菌属同源性最高,均高于99%。这七株菌主要脂肪酸为C16:0、C16:03-OH、C18:1ω7c、C19:OCYCLOω8c及Summed feature 2 （C16:1 ISO I/C14:03OH）,通过对这七株菌的表型特征、系统发育、脂肪酸进行分析,它们都属于土壤杆菌属。其次,对这七株菌进行砷氧化定性和定量鉴定。结果表明这七株菌都具有高效的砷氧化作用,均可在11h内完成As（Ⅲ）氧化过程,其中,菌株5A,菌株C13从第6h开始氧化As（Ⅲ）为As（V）,而其它几株菌都是在第5h开始氧化As（Ⅲ）为As（V）。这七株菌对重金属抗性水平也有所不同,其中明显区别在于菌株5A对As（Ⅲ）的抗性最低,仅为4mM,而菌株GW4对Sb（Ⅲ）抗性水平最高,可达7mM。最后,对这七株菌进行生理特性的研究,结果表明,这七株菌都有铁载体（siderophore）分泌能力、吲哚乙酸（IAA）合成能力,并且都没有固氮能力。综上,通过对这七株菌的进行多项分类分析,结果表明这七株菌都属于土壤杆菌属。通过对它们特性进行研究,结果发现这些分离自不同砷污染样品的砷氧化土壤杆菌都具有一定的砷抗性及砷氧化能力,并且还具有分泌IAA和铁载体能力,表明它们是具有砷抗性及砷氧化能力的植物促生菌。而这些菌对砷的抗性及促植物生长能力的不同可能与它们的分离环境相关。因此,相信它们在砷污染修复上有极大的应用价值,尤其是在微生物与植物联合修复砷污染土壤方面有非常大的应用前景。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略语表
• 第一章 放线细菌新种的鉴定
• 1.1 前言
• 1.1.1 放线菌在微生物中的分类地位
• 1.1.2 放线菌多项分类学
• 1.1.3 放线菌多项分类学中的常用技术
• 1.1.3.1 经典分类
• 1.1.3.2 化学分类
• 1.1.3.3 基因型分类
• 1.1.4 间孢囊菌科
• 1.1.4.1 Knoellia属
• 1.1.4.2 鉴定标准
• 1.1.5 研究目的与意义
• 1.2 材料与方法
• 1.2.1 实验材料
• 1.2.1.1 样品
• 1.2.1.2 培养基
• 1.2.1.3 参考菌株
• 1.2.2 实验方法
• 1.2.2.1 菌种分离
• 1.2.2.2 表型特征
• 1.2.2.3 化学分类学特征
• 1.2.2.4 基因型特征
• 1.2.2.5 系统发育学分析
• 1.3 结果与讨论
• 1.3.1 放线细菌菌种分离
• 1.3.2 表型特征
• 1.3.2.1 形态学特征
• 1.3.2.2 生长特性
• 1.3.2.3 生理生化特性
• 1.3.3 化学分类学特征
• 1.3.3.1 脂肪酸分析
• 1.3.3.2 呼吸醌类型分析
• 1.3.3.3 极性脂分析
• 1.3.3.4 细胞壁肽聚糖分析
• 1.3.4 基因型特征
• 1.3.4.1 16S rRNA基因分析
• 1.3.4.2 DNA（G+C）mol%分析
• 1.3.4.3 DNA-DNA杂交结果分析
• 1.3.5 系统发育学分析
• 1.3.6 分析与讨论
• 第二章 砷氧化土壤杆菌特性研究
• 2.1 前言
• 2.1.1 砷及其化合物
• 2.1.2 砷污染
• 2.1.3 砷氧化代谢机制
• 2.1.4 植物促生菌PGPB
• 2.1.4.1 合成植物激素
• 2.1.4.2 分泌铁载体
• 2.1.4.3 联合固氮作用
• 2.1.4.4 分泌ACC脱氨酶
• 2.1.4.5 促进植物对磷的吸收
• 2.1.5 土壤杆菌属（Agrobacterium）简介
• 2.1.6 砷污染生物修复
• 2.1.7 研究目的与意义
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 实验材料
• 2.2.1.1 培养基
• 2.2.1.2 实验菌株
• 2.2.2 实验方法
• 2.2.2.1 菌种鉴定
• 2.2.2.2 砷氧化菌的表型鉴定及氧化曲线制作
• 2.2.2.3 砷氧化菌As（Ⅲ）及其他重金属抗性水平
• 2.2.2.4 生理特性鉴定
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 菌种鉴定
• 2.3.2 砷氧化菌的鉴定结果
• 2.3.2.1 砷氧化菌的表型鉴定
• 2.3.2.2 砷氧化菌砷氧化曲线制作
• 2.3.3 砷氧化菌As（Ⅲ）及其他重（类）金属抗性水平
• 2.3.4 生理特性鉴定
• 2.3.4.1 铁载体分泌能力鉴定
• 2.3.4.2 IAA生成能力鉴定
• 2.3.4.3 固氮特征的鉴定
• 2.3.5 分析与讨论
• 参考文献
• 致谢
• 发表论文情况