痢疾志贺菌A1型IroN、ShuA单、双突变体的构建及功能分析

论文摘要

本文以基因敲除方法研究痢疾杆菌的功能基因，以RecA重组系统为基础，采用低拷贝自杀质粒pCVD442作为本敲除体系的重组载体，为了克服该质粒在进行分子克隆操作中的困难，将Gateway技术应用在敲除前期的重组质粒构建过程中，成功构建了痢疾志贺菌A1型SD51197株运铁相关基因IroN、ShuA部分缺失和插入的单、双突变体MTS-1、MTS-2、MTS，从而建立了在痢疾杆菌中进行定位插入或缺失突变的敲除技术平台。对各突变株分别在培养基、细胞和动物三个水平进行了功能检测。在丰富培养基中各突变株与野生株生长没有显著差异；在添加150μM铁鳌合剂DIP的条件下，各突变体的生长水平都从4h开始明显低于野生株，在培养基中补加铁离子可以使各突变株的生长回复到丰富培养基条件下的水平；在HeLa细胞和U937细胞的胞内存活增殖能力和胞间扩散能力以及豚鼠角膜结膜炎实验中，各突变株均没有明显的毒力变化，但在HeLa细胞侵袭过程中添加65μM的DIP，突变株MTS-1、MTS-2、MTS的胞内存活增殖能力与野生株相比下降了1／4～1／2。上述结果提示痢疾杆菌中IroN、ShuA基因与细菌的铁转运相关，可能由于细菌中其它铁转运相关系统的存在代偿了敲除基因的功能缺陷，因此突变体在毒力水平没有特别显著的变化。利用SD51197全基因组芯片进行了铁丰富和铁限制条件下突变株和野生株的表达谱比较分析，结果表明：铁丰富条件下各突变体上调基因数目多于下调基因，双突变体中变化基因的数目及幅度高于任意单突变体。铁限制条件下，整体上各突变体对缺铁的变化比野生株更敏感，各突变体下调基因数目及幅度明显高于上调基因，双突变体中变化基因的数目及幅度高于任意单突变体，均高于野生株；上调的基因主要涉及转录、辅酶代谢、氨基酸代谢和功能未分类基因，而下调基因中参与能量代谢和碳水化合物代谢的较多，还有许多功能未分类的基因；一些已知的转铁相关基因普遍上调，且各突变株中上调基因的数目及幅度均高于野生株。此结果表明运铁相关基因IroN、ShuA对志贺氏菌的生长具有一定的影响。利用Gateway技术与自杀质粒相结合的敲除体系具有高效高通量的特点。本研究建立了一种对痢疾杆菌功能基因组研究有效的基因敲除技术平台，并且提供了对痢疾杆菌中未知功能基因研究值得参考的新思路。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 痢疾志贺菌A1型 IroN、ShuA单、双突变体的构建及功能分析
• 前言
• 第一节 材料与方法
• 1. 实验材料
• 1.1 菌株与生长条件
• 1.2 质粒
• 1.3 细胞系
• 1.4 实验动物
• 1.5 所用扩增及测序引物
• 1.6 试剂、常用溶液和培养基的配制
• 1.7 实验用酶和试剂盒
• 1.8 实验器材与仪器
• 2. 实验方法
• 2.1 目的基因片段的回收
• 2.2 连接反应
• 2.3 感受态细胞的制备
• 2.4 连接产物的转化
• 2.5 质粒 DNA的快速小量制备
• 2.6 基因芯片的实验操作步骤
• 2.7 DNA的T载体序列测定
• 2.8 生长曲线的测定
• 2.9 细胞感染实验
• 2.10 噬斑分析
• 2.11 细菌在细胞内存活实验
• 2.12 细胞染色
• 2.13 豚鼠角膜结膜炎实验
• 第二节 突变株的构建
• 1. IroN缺失突变株（MTS-1）的构建
• 1.1 重组同源臂区域的选取和引物设计
• 1.2 entry载体的构建
• 1.3 destination载体的构建
• 1.4 同源重组质粒的构建
• 1.5 同源重组过程
• 1.6 突变株的获得和验证
• 2. ShuA插入突变株（MTS-2）的构建
• 2.1 重组同源臂区域的选取和引物设计
• 2.2 entry载体的构建
• 2.3 destination载体的构建
• 2.4 同源重组质粒的构建
• 2.5 同源重组过程
• 2.6 突变株的获得和验证
• 3. IroN、ShuA双敲除突变株（MTS）的构建
• 3.1 同源重组质粒的制备
• 3.2 同源重组
• 3.3 双突变株的获得和验证
• 4. 小结
• 第三节 突变株性状与功能检测及表达谱分析
• 1. 突变株性状与功能检测
• 1.1 正常培养基条件下的生长情况
• 1.2 铁限制条件下的生长情况
• 1.3 细胞水平对突变株和野生株的比较实验
• 1.4 突变株毒力的动物实验检测
• 2. 突变株和野生株的表达谱分析
• 2.1 RNA的制备
• 2.2 表达谱分析
• 3. 小结
• 第四节 结论
• 第五节 讨论
• 第二章 痢疾杆菌毒力因子及研究方法综述
• 第一节 痢疾杆菌毒力因子
• 1. 痢疾杆菌侵袭性质粒上的毒力决定因子
• 2. 染色体上的毒力相关基因
• 3. 痢疾杆菌毒力基因的调控
• 第二节 病原菌毒力基因的研究方法
• 1. 突变方法
• 2. 差异表达识别法
• 结束语
• 参考文献
• 致谢
• 附录