转录因子HY5在拟南芥乙烯生物合成及信号转导中的功能分析

论文摘要

植物在生长发育过程中不可避免的遭受到各种生物和非生物胁迫,如低温、干旱、盐、病虫害等,植物在高盐应答过程中形成了一套有效地应答机制,其中包括植物激素ABA （abscisic acid）和乙烯信号应答调控途径。利用乙烯过量生成突变体（ethylene overproduction, eto）及过表达ACS5转基因植株（OEACS5）表明增加乙烯的生物合成能提高拟南芥种子萌发及幼苗生长发育早期的耐盐性,乙烯合成抑制剂AVG （aminoethoxyvinylglycine）和乙烯作用的抑制剂AgNO3降低了eto突变体及OEACS5转基因株系盐胁迫条件下的种子萌发率和绿苗率。芯片分析与Real-time PCR结果显示种子萌发的重要调控因子基因ABI5在eto突变体及OEACS5转基因植株中的表达量降低,而乙烯信号传导途径下游突变体ein2、ein3-1中ABI5的表达量明显高于Col-0,且外源ACC能有效的抑制盐诱导的ABI5表达。由于HY5调控ABI5的基因表达影响植物的耐盐性,而且研究表明hy5在种子萌发及幼苗生长时期具有抗盐表型。在eto2中过表达HY5 （eto2×35S::HY5）能降低eto2在盐培养基上的种子萌发率,高盐胁迫条件下ein2单突变体几乎不能长出绿色子叶,而ein2 hy5双突变体的绿苗率回复到野生型水平;在etr1-1 hy5及ein3-1 hy5双突变体盐胁迫下的种子萌发率明显高于Col-0和单突变体etr1-1与ein3-1。这些结果表明乙烯通过其信号传导途径影响HY5,从而抑制ABI5的表达提高植物在高盐条件下的种子萌发率。进一步研究发现hy5突变体释放的乙烯量相对野生型增加了1.5倍,其组成型表达的转基因植株乙烯含量与野生型相比没有变化。Real-time PCR检测拟南芥中ACS基因表达发现ACS2和ACS5在hy5中表达增加,且ABA处理不同时间后ACS2和ACS5在hy5中均维持高水平表达。体外EMSA （Electrophoretic mobility shift assay）和体内ChIP （Chromatin immunoprecipitation）实验表明HY5能与转录抑制因子AtERF11启动子中的G-box序列结合并调控其基因表达;乙烯的“三重反应”实验表明10μM ACC条件下erf11突变体的下胚轴生长相比于野生型更短。ABA处理Col-0后乙烯释放量降低了一半而对erf11中的乙烯释放量没有影响,Real-time PCR结果表明erf11的突变体中ACS2和ACS5表达量在ABA处理前后明显高于野生型。进一步用体外EMSA和体内ChIP实验证明AtERF11能与ACS2和ACS5启动子中的DRE （Dehydration-responsive Element）相结合并调控其表达。ABA处理acs2-1突变体后发现其主根和地上部生长都受到强烈抑制;acs5-1与acs5-2两个等位突变体与野生型相比较都表现为主根生长受到ABA更明显的抑制,而地上部鲜重受到的影响不明显,这表明ACS2和ACS5是ABA调控乙烯合成的重要位点。乙烯释放只有野生型25%的ACS七突变体heptuple （acs1、2、4、5、6、7、9）令人意外的表现出主根生长不受ABA影响,但是侧根生长非常敏感。而乙烯含量升高40%的突变体acs4-1主根生长也不受ABA的抑制。表明乙烯与ABA在体内调控植物生长在不同的部位有不同的互作方式。ABA处理后乙烯过量生成的突变体eto1、eto2、eto3乙烯的释放量明显降低,表型分析发现eto1、eto2和eto3增强了ABA的耐受性,以上这些结果表明ABA在转录水平上调控HY5-AtERF11转录级联调控途径调控乙烯的生物合成。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 前言
• 1.1 国内外研究现状
• 1.1.1 植物乙烯研究进展
• 1.1.2 拟南芥HY5 的研究进展
• 1.2 研究目的与意义
• 第二章 HY5 在乙烯盐胁迫应答中的功能分析
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 方法
• 2.2 结果
• 2.2.1 乙烯生物合成及信号传导突变体的耐盐性表型
• 2.2.2 eto 突变体耐盐性分析
• 2.2.3 乙烯合成及作用抑制剂对耐盐性的影响
• 2.2.4 过表达ACS5 拟南芥表型分析
• 2.2.5 过表达ACS5 转基因植株的耐盐性表型分析
• 2.2.6 芯片结果分析
• 2.2.7 芯片结果验证
• 2.2.8 盐处理前后eto 突变体ABA 含量测定
• 2.2.9 ABI5 在乙烯相关材料中的转录水平表达量分析
• 2.2.10 外源ACC 对拟南芥耐盐性影响分析
• 2.2.11 ABI5 的调控因子HY5 的耐盐性分析
• 2.2.12 过表达HY5 增加eto2 的盐敏感性
• 2.2.13 HY5 在乙烯抗盐途径中具有负调控作用
• 2.3 讨论
• 第三章 HY5 在乙烯合成中的调控功能
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 方法
• 3.2 结果
• 3.2.1 ABA 诱导ACS 基因表达分析
• 3.2.2 hy5 乙烯含量测定
• 3.2.3 ABA 诱导hy5 中乙烯合成相关基因的表达分析
• 3.2.4 ABA 处理后hy5 中含EAR 基序ERF 基因的表达分析
• 3.2.5 AtERF11 启动子分析
• 3.2.6 HY5 与AtERF11 启动子体外结合分析
• 3.2.7 HY5 与AtERF11 启动子体内结合分析
• 3.2.8 erf11 突变体鉴定与乙烯表型分析
• 3.2.9 ABA 处理前后erf11 突变体ACS 基因的表达变化
• 3.2.10 ABA 处理前后erf11 乙烯含量变化及ACS 基因的表达分析
• 3.2.11 AtERF11 结合特性分析
• 3.2.12 AtERF11 与ACS 基因启动子结合分析
• 3.2.13 acs 突变体ABA 表型分析
• 3.2.14 eto 突变体ABA 表型分析及乙烯含量测定
• 3.3 讨论
• 第四章 全文结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简历