论文摘要
牙周组织的修复包含了一部分在牙周区域存在的前体细胞的参与,并且这些细胞具备自我更新、多向分化（可向成纤维细胞、成骨细胞和成牙骨质母细胞分化）的间充质干细胞的特性[1,2],但对于这些前体细胞的来源问题,截至目前一直没有明确的答案。有研究表明这些前体细胞主要集中于牙周韧带血管旁区域；并且牙槽骨骨内膜区域的前体细胞也具备从牙槽骨向牙周韧带迁移的潜能[3,4]。有意义的是,这些牙周韧带前体细胞的血管旁定位提示我们骨髓可能是这些前体细胞的来源[4]。体外实验研究发现骨髓基质干细胞（bone marrow stem cells, BMSCs）与牙周成纤维细胞共同培养时,具有体内牙周成纤维细胞的特性,能够使骨桥素（osteopontin, OPN）和骨钙素（osteocalcin, OC）的表达显著增加,而骨涎蛋白（bone sialoprotein, BSP）的表达明显降低[5]。体内研究显示,白体BMSCs移植入犬牙周骨缺损区,BMSCs能在缺损区成活、增殖,并促使牙周组织再生[6,7]；将复合到明胶微载体颗粒中的GFP+（green fluorescent protein）的BMSCs局部应用于大鼠牙周缺损模型中,可观察到阳性细胞参与到牙周组织的各个部分（牙周膜、牙槽骨和牙骨质）的重建[8]。这些事实说明：BMSCs具有分化为牙周前体细胞并进一步促进牙周组织再生的能力。有研究表明,当器官受损时,移植的骨髓基质细胞在损伤期间能迁移/归巢至受损部位,并修复该受损区[9],而经静脉移植的MSCs可以特异性的迁移到病变组织,在适合其生存的微环境下分化,最终改善器官的功能。已有的研究结果提示病变组织可能存在某些分子,在其形成的浓度梯度的诱导下实现了MSCs的趋化。而聚集到损伤部位的成体干细胞行使其修复功能的机制可能有：分化为适合的细胞类型；提供一定的细胞因子和其它类型的因子以增强内源性细胞的修复功能等[10]。而Li shu等通过将荧光素酶和GFP双标的BMSCs方法经尾静脉输入小鼠体内,已证实系统骨髓来源的MSCs能够参与颌骨和颅骨的骨再生[11],这一结果更加坚定了我们的猜测：1、系统移植的骨髓基质细胞能够归巢至牙周缺损区；2在炎症刺激作用下,骨髓来源的MSC也可募集牙周受损区域周围的MSCs迁移到受损区域,并与之共同参与及调控牙周组织的修复与再生；3、牙周膜干细胞或牙周区域的成体干细胞部分来源于系统骨髓。故本研究中我们经过骨髓腔内注射移植增强型绿色荧光蛋白标记的骨髓来源的间充质干细胞（BM-MSCs）,通过建立牙周急性炎症缺损模型来探讨系统骨髓源性细胞在牙周组织的创伤修复与再生过程中的作用,为下一步利用趋化因子趋化BM-MSCs和内源性的其它干细胞应用于原位组织工程的可行性提供一定的理论依据。材料和方法第一部分：本实验采用Percoll密度梯度离心的方法,分离培养大鼠骨髓来源的间充质干细胞（rBM-MSCs）。通过有限稀释法来判断rBM-MSCs的克隆形成能力；通过诱导其三向分化来鉴定分离的细胞,在体外以0.μM地塞米松,10mMβ-甘油磷酸钠,50μM抗坏血酸磷酸盐诱导rBM-MSCs向成骨细胞分化,并以茜素红染色鉴定；以1μM地塞米松,200μM吲哚美辛,10μM胰岛素和0.5mM 3—异丁基—1—甲基黄嘌呤诱导rBM-MSCs向脂肪细胞分化,并用油红O（Oil Red O）染色鉴定；以50nM抗坏血酸,10ng/ml转录生长因子β1（transforming growth factor-β1,TGF-β1）和6.25μg/ml胰岛素诱导rBM-MSCs向软骨细胞分化,并以阿尔新兰染色鉴定。应用脂质体转染的方法,将第三代慢病毒包装系统,包括携带增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein,EGFP）基因的慢病毒表达载体pBPLV、慢病毒包装质粒pLP1、pLP2和包膜质粒pLP/VSVG转入包装细胞293FT。进而用获得的慢病毒攻击靶细胞rBM-MSCs,实现EGFP基因的转入,并通过流式分选的方法对转染后的细胞进行分选,以获得稳定强表达EGFP基因的rBM-MSCs用于后续的实验。通过MTT实验检测转染前后细胞增殖的变化,以确定转染对细胞的影响。第二部分：为实现EGFP+ rBM-MSCs体内的顺利移植,我们对SD大鼠进行60Coγ,射线8.0Gy全身照射（total body irradiation, TBI）的预处理方案,分别通过骨髓腔内注射和尾静脉注射的方法将细胞输入动物体内。移植后3周,建立牙周组织炎症缺损模型,并在术后的1周、2周、4周、6周通过荧光显微镜直接观察确定EGFP+ rBM-MSCs在牙周缺损手术区域的分布情况,DAPI（4’,6-二乙酰基-2-苯基吲哚）染色,荧光显微镜下计数确定迁移的阳性细胞数,并通过H&E染色、Masson染色观察比较牙周组织修复在组间和时相之间的差异,通过免疫组化检测GFP、骨桥素和Ⅰ型胶原在牙周组织缺损区域内的表达,进一步验证我们上述的观察结果。结果：第一部分：经过Percoll密度梯度离心法我们获得了比较纯的、细胞的大小和形态接近一致的rBM-MSCs。克隆形成实验结果,CFU-F的形成率＞50%,证明rBM-MSCs具备较强的克隆形成能力。经骨向诱导4周,茜素红染色后可见致密红染的细胞外基质沉积和矿化结节的形成。经脂向诱导后,油红O（Oil Red O）染色可观察到阳性染色的脂肪滴形成。经软骨细胞分化诱导后,阿尔新兰染色（Alcian blue）结果观察到rBM-MSCs培养物内可见类软骨样嗜阿尔新兰染色的基质。说明分离培养的rBM-MSCs具备三向分化的潜能。采用第三代的慢病毒包装系统包装293FT细胞,效率达到95%以上,收集的病毒施行靶细胞的转染,荧光显微镜下可观察到大量GFP阳性细胞的存在。将转染后的细胞经过流式细胞分选术后,确定阳性比例为60%左右,并将其中40%强表达EGFP的rBM-MSCs分选收集,进行扩大培养。通过MTT检测确定,转染后EGFP+的rBM-MSCs的增殖与转染前相比无显著性差异,细胞形态和生长状态均良好,体外连续培养可稳定传代。第二部分：为提高移植细胞的移植效率,我们采用60Coγ射线,8.0Gy总量（剂量率1.0Gy/min）进行全身照射（TBI）的预处理方案。照射后,经过骨髓腔内注射移植细胞的实验大鼠生存状态比尾静脉移植组的大鼠好,且持续到整个实验结束。通过DAPI染色,荧光显微镜直接观察显示EGFP+的rBM-MSCs在术后1周即可迁移到牙周缺损手术区域,到2周时,迁移的细胞数达到最高,并且在新形成的骨岛中可观察到绿色阳性细胞的存在,且新生血管周围分布着大量阳性细胞。在术后4周,新生牙周膜和牙骨质中也观察到阳性细胞的存在。通过计数统计,与非炎症缺损模型组相比,炎症缺损模型组在相同时间点,迁移的细胞数目高,且有统计学差异（P<0.05）。与尾静脉移植组相比,骨髓腔内移植组在术后1w和2w迁移的阳性细胞数较多,且有统计学差异（P＜0.05）。H&E染色和Masson染色显示,骨髓腔内移植炎症缺损模型组具有较强的新骨形成能力、牙周膜重建和新牙骨质形成的能力。骨桥素（OPN）免疫组化显示,缺损区内见大量阳性细胞,细胞外基质中也有较强骨桥素表达。新骨形成越活跃的地方,骨桥素阳性表达也越强。Ⅰ型胶原免疫组化染色也显示缺损区内部见Ⅰ型胶原染色呈棕色,主要分布在新骨形成区。而GFP免疫组化结果也证实上述棕染区为移植的EGFP+ rBM-MSCs来源的细胞。结论：1、rBM-MSCs可以在体外成功分离培养、扩增和纯化,并且具备干细胞的特性即较强的克隆形成能力和向成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞分化的潜能。慢病毒包装系统可成功转染rBM-MSCs且转染效率高,不影响干细胞增殖能力。标记后的EGFP+的rBM-MSCs可用于观察rBM-MSCs在体内的存活、迁徙及分化。表明慢病毒包装细胞是一种高效、安全的转染方式。2、经8.0Gy全身照射（TBI）的预处理方案,尾静脉和骨髓腔内注射移植EGFP+的rBM-MSCs均可到达手术区域牙周组织的各个部分（新生牙周膜、牙槽骨和牙骨质）,并且与尾静脉移植组相比,骨髓腔内注射移植是一种有效的干细胞移植法。荧光显微镜的观察结果和H&E染色、Masson染色和免疫组化相结合,证实急性炎症缺损能够迅速的趋化大量的EGFP+的rBM-MSCs迁移到缺损区,迁移到的部分阳性细胞可分化为成骨细胞,且绿色阳性细胞在新生牙骨质内的定位提示成牙骨质细胞部分来源于系统骨髓。同时新生血管周围分布大量阳性细胞,且阳性细胞同新生的牙周膜纤维伴行,提示牙周膜干细胞部分来源于骨髓来源的间充质干细胞,并提示迁移来的EGFP+ rBM-MSCs通过部分直接分化为功能细胞,并且通过旁分泌的方式分泌大量生物活性因子,促进血管形成,而新生区非阳性功能细胞的存在提示EGFP+ rBM-MSCs趋化受体大鼠牙周受损区域周围的干细胞或前体细胞迁移到受损区域,并通过促进这些细胞的分裂、增殖和分化来促进牙周组织的修复和再生。