猪卵泡囊肿的发病机理研究

论文摘要

卵巢囊肿是母畜动物一种常见的繁殖障碍性疾病,可分为卵泡囊肿和黄体囊肿,临床上以卵泡囊肿较多见。卵泡囊肿是引起母猪不孕的主要疾病之一,该病导致母猪不能排卵,以无规律的频繁发情和持续发情为主要特征。自1831年发现以来,科研人员从多方面进行了大量的研究。目前,该病已在多种动物中有报道,如牛、羊、猪、小鼠、人等动物均有报道。据统计,该病的发病率占淘汰成年母猪的10%,牛的发病率在10-13%,水牛的发病率在2.8%到4.2%。该病的发生大大降低母畜动物的繁殖性能,给养殖业造成了巨大的经济损失。在育龄妇女中,多囊卵巢综合征（PCOS）的发病率约5%,占无排卵不孕的70%。临床上的高发病率,迫切需要对该病有系统的了解,从而有效的控制该病的发生。引起卵泡囊肿发生的原因很多,内分泌失调一直是大家公认的重要发病机理。由于下丘脑-垂体-卵巢轴的功能异常协同作用,导致整个动物机体的内分泌发生紊乱,打破正常的发情周期,使成熟卵泡不能排卵,从而导致囊肿的发生。在这一过程中,卵巢作为多种激素的效应器官,其自身的功能是否正常对于维持下丘脑-垂体-卵巢轴整个内分泌系统的稳定具有重要作用。有文献报道,阻断LH排卵峰的主要因素存在于卵巢本身,可见卵巢局部因子对卵泡囊肿的发生具有重要的调节作用。而卵泡液是集动物机体的内分泌、旁分泌和自分泌为一体的综合反应,卵泡液中的成分反映了卵泡激素合成、卵泡细胞代谢、卵子成熟、排卵、和黄体化过程中的生理和病理现象。目前,卵泡液已经成为研究动物机体繁殖障碍疾病的独特窗口。卵泡液中的蛋白在卵泡发育、卵母细胞成熟过程中具有重要的作用。检测卵泡液的蛋白成分、蛋白浓度以及特定蛋白的功能研究,对进一步了解卵泡发育和卵母细胞成熟的生理过程具有重要的生物学意义。目前,利用蛋白质组学方法研究动物机体生理和病理状态下卵泡液蛋白变化已应用于多种动物,在人、小鼠、牛等均有报道,其中报道较多的是人,但在猪还没有报道。另外,卵泡闭锁是一种正常的繁殖生理过程,而细胞凋亡是卵泡闭锁启动和发生的主要机制。最近有报道,排卵紊乱后卵泡延迟闭锁、退化是导致囊肿持久存在的另一机制,而囊肿卵泡细胞的凋亡频率下降是导致囊肿发生和存在的重要因素。因此,本文利用蛋白质组学方法从囊肿卵泡液中筛选出与囊肿发生相关的蛋白,有望成为囊肿卵泡液的候选标记蛋白；同时检测囊肿卵泡细胞的凋亡与增殖情况,从而进一步探索猪卵泡囊肿的发病机制。主要研究结果如下：1、形态组织学观察和激素检测囊肿卵泡的形态组织学和激素含量均发生了改变。囊肿卵巢的重量、体积、卵泡直径均明显大于正常卵巢,差异极显著；组织学观察发现,囊肿卵泡的颗粒细胞层变薄、基底膜部分消失,这可能直接影响到卵泡细胞的代谢能力和分泌功能；血液中LH和P4的含量均升高,卵泡液中的P4含量明显高于正常组,差异极显著。以上结果表明本课题所用囊肿卵泡为后期的卵泡囊肿;2、猪囊肿卵泡液中的差异蛋白筛选和功能鉴定基于2-DE的比较蛋白质组学技术,建立了猪的卵泡液蛋白质图谱；每张蛋白质图谱上分离到大约300个蛋白点,通过软件分析比较小卵泡、中卵泡、大卵泡和囊肿卵泡卵泡液蛋白,获得小卵泡与中卵泡之间差异表达蛋白点23个：中卵泡与大卵泡之间差异表达蛋白点19个；大卵泡与囊肿卵泡之间差异表达蛋白点40个。并利用HDMS成功鉴定了32个差异表达蛋白点,对应28种蛋白质,其中75%是首次在猪卵泡液中检测到。鉴定蛋白经生物信息学分析,大至可以分为与细胞代谢、信号转导、核酸代谢、细胞骨架、细胞凋亡、免疫等相关蛋白和未知蛋白几个类群,其中与细胞代谢相关蛋白所占比例最大。RBP-4和ApoA-I有望成为猪卵泡囊肿的候选标记蛋白。为进一步研究鉴定蛋白的来源和功能,我们从颗粒细胞中提取总RNA,同时进行体外培养颗粒细胞和卵母细胞。利用RT-PCR和ELISA方法检测,表明转铁蛋白和RBP-4不仅来源于血液,也可来源于颗粒细胞;然后转铁蛋白分别以不同浓度1 ng/mL.10 ng/mL.100 ng/mL)添加到卵母细胞成熟液中观察在卵母细胞成熟过程中的作用,结果表明,转铁蛋白对猪卵母细胞的卵丘细胞扩散和极体排出率（PBI）影响均不明显。3、囊肿卵泡中的细胞凋亡和增殖检测通过TUNEL方法对正常卵泡、闭锁卵泡和囊肿卵泡的细胞凋亡频率检测发现,囊肿和闭锁卵泡的颗粒细胞层均有凋亡细胞：囊肿卵泡中的凋亡细胞频率低于闭锁卵泡。另外,还检测了凋亡相关因子（XIAP, bax, bcl-2, caspase-3）在正常和囊肿卵泡中的表达,利用免疫组化检测发现,caspase-3阳性染着色于细胞核和细胞质,在闭锁卵泡中着色较强,而在囊肿卵泡的颗粒和内膜层均有少量的阳性细胞,与正常卵泡相似;bcl-2在正常和囊肿卵泡中阳性频率较高：bax在闭锁卵泡中的表达较高,在正常和囊肿卵泡中的表达均较弱; XIAP阳性细胞在正常和囊肿卵泡的颗粒细胞层表达较高,在闭锁卵泡表达较弱。而且与正常卵泡相比,bcl-2和XIAP mRNA和蛋白在囊肿卵泡的表达量较高,而bax和caspase-3 mRNA和蛋白表达量较低。以上结果表明,囊肿卵泡中细胞凋亡频率的下降,可能与抗凋亡因子和促凋亡因子在母猪体内的表达紊乱有关。同时,我们也对囊肿卵泡中的增殖相关因子（PCNA）的表达和颗粒细胞、内膜细胞的增殖指数进行了检测。结果表明,PCNA阳性细胞频率在闭锁卵泡和囊肿卵泡中的表达均低于正常卵泡,差异极显著；PCNA mRNA和蛋白在囊肿卵泡中的表达也低于正常卵泡。表明囊肿卵泡的颗粒细胞和内膜细胞层的细胞增殖活性降低。以上细胞凋亡和增殖检测结果表明,囊肿卵泡的微环境使卵泡细胞的凋亡和增殖发生了改变,较弱的细胞增殖活性和较低的细胞凋亡频率是猪囊肿卵泡的一个新特征。综上所述,本文首次建立了猪卵泡液蛋白质图谱,75%的鉴定蛋白是首次在猪卵泡液中鉴定到,丰富了卵泡液蛋白质组学的内容。RBP-4和ApoA-I有望成为猪卵泡囊肿的候选标记蛋白。进一步研究发现,卵泡液中的转铁蛋白和RBP-4不仅来源于血液,也可来源于颗粒细胞；表明囊肿卵泡液中的蛋白含量和成分的改变与卵泡壁的通透性和卵泡细胞的代谢能力有关。另外,囊肿卵泡的微环境使卵泡细胞的凋亡和增殖发生紊乱,较弱的细胞增殖活性和较低的细胞凋亡频率是猪囊肿卵泡的一个新特征。囊肿卵泡的缓慢生长导致卵泡处于停滞状态而没有发生退化,这可能是导致囊肿卵泡持久存在、延迟闭锁退化的机制之一。本研究将为揭示猪卵泡囊肿发病机制提供新的理论基础。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 前言
• 第一篇 文献综述
• 第1章 卵泡液比较蛋白质组学的研究进展
• 1 蛋白质组学研究技术
• 2 比较蛋白质组学在卵泡发育研究中的应用
• 3 存在的问题和展望
• 第2章 卵巢囊肿的研究进展
• 1 卵巢囊肿的特征
• 2 卵巢囊肿的发病机制
• 3 卵巢囊肿的发展结局
• 4 卵巢囊肿的治疗
• 第二篇 研究内容
• 第1章 利用比较蛋白质组筛选与母猪卵泡囊肿发生相关蛋白
• 第1节 双向电泳技术分离卵泡液蛋白
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 4 小结
• 第2节 差异蛋白的质谱鉴定及验证
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 4 小结
• 第3节 囊肿相关蛋白的来源和功能鉴定
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 4 小结
• 第2章 囊肿卵泡细胞的凋亡与增殖检测
• 第1节 囊肿卵泡的细胞凋亡检测
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 4 小结
• 第2节 囊肿卵泡的细胞增殖检测
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 4 小结
• 结论
• 参考文献
• 攻读学位期间发表的学术论文及其它成果
• 致谢
• 导师简介
• 作者简介