花生脂肪酸代谢关键酶基因的克隆与表达分析

论文摘要

花生是我国主要油料作物,其总产居各油料作物之首,花生品质改良育种对我国的经济发展具有重要意义。传统的育种技术周期长,特定成分提高幅度有限,农艺性状难以综合。基因工程为作物品种遗传改良提供了一个高效的技术手段,可以大大缩短育种周期和提高育种效率。因此,应用基因工程技术对花生脂肪酸组分改良具有重要理论与实践意义。本研究以花生品种E12幼苗为材料提取总RNA,并分离mRNA,利用SMART （Switching Mechanism at5’end of RNA Transcript）技术合成双链cDNA。经限制性内切酶SfiⅠ酶切,将经过分级分离得到的cDNA连接到改造的质粒载体pBluescriptⅡSK,构建了花生幼苗cDNA文库。经检测,所构建丈库的滴度为1.1×106cfu/mL,重组率为93.4%,插入片段大小为750～2000bp。利用高通量测序技术获得大批高质量序列,利用生物信息学方法进行Unigene归并和序列注释分析,得到了4074条Unigenes,其中3897条序列有相关同源信息。从构建的cDNA文库中获得了两个磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（phosphoenolpyruvate carboxylase,简称PEPC）基因片段（编号为HS096-h02和HS092-d05）,通过RACE和RT-PCR方法,获得两个花生PEPC基因序列,分别命名为AhPEPC1（GenBank登录号：EU391629）和AhPEPC2（GenBank登录号：FJ222240）；同时,根据公布的拟南芥PEPC基因家族的4个基因和大豆PEPC基因家族的5个基因,设计简并引物,利用RACE技术结合RT-PCR方法,从花生中分离了另外三个PEPC基因,分别命名为AhPEPC3（GenBank登录号FJ222826）, AhPEPC4（GenBank登录号：FJ222827）和AhPEPC5（GenBank登录号FJ222828）。AhPEPC1-5基因开放阅读框长度为2,907bp,2,901bp,2,901bp,2,910bp和3,111bp；分别编码968,966,966,969和1036个氨基酸残基。荧光定量PCR结果显示,花生AhPEPCl、AhPEPC2、AhPEPC3、AhPEPC4和AhPEPC55个基因在普通花生和高油分花生品种的四种不同组织（根、茎、叶和种子）中都有表达,表达模式各不相同。除AhPEPC2外,AhPEPC1、AhPEPC3、 AhPEPC4、AhPEPC5四个基因在普通花生中的表达量均显著高于高油分花生品种。从构建的cDNA文库中还获得了一个花生β-酮脂酰-ACP合成酶Ⅱ（beta-ketoacyl-ACP synthetase Ⅱ,简称KAS Ⅱ）基因和一个硬脂酰-载体蛋白去饱和酶（Stearoyl-ACP desaturase,简称SAD）基因的部分序列（编号为HS137H08）,以此为基础,利用RACE方法扩增得到包含这两个基因完整编码区的cDNA序列,分别命名为AhKAS II （GenBank登录号：FJ358425）和AhSAD （GenBank登录号：FJ230310）。获得的AhKAS I序列长度为1867bp,编码404个氨基酸；AhSAD序列长度为1499bp,编码406个氨基酸。采用荧光定量PCR技术对这两个基因在不同花生品种、不同花生组织（根、茎、叶和种子）中的表达分别进行研究,结果表明这两个基因在花生不同组织中的表达差异都十分显著,AhKAS1基因在种子中的表达最为突出,AhSAD在种子和叶中的表达量最高,推测这两个基因可能在植物种子的生长发育过程中起重要的作用,另外不同花生品种间的基因表达量也存在差异。利用生物信息学方法,从普通花生和高油酸花生品种中分别获得了△12脂肪酸脱氢酶基因的全长cDNA序列,分别命名为AhFAD2B和AhFAD2B’。分析两个基因的编码区序列发现,AhFAD2B’基因序列在起始密码子后第442bp处有碱基A的插入,导致编码区提前终止,编码一个截短蛋白AhFAD2B’,丢失了一个膜结合蛋白保守的组氨酸框。表达分析显示,AhFAD2B在高油酸花生品种中的表达量显著低于普通花生品种中的表达量。利用酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）进行AhFAD2B和AhFAD2B’基因编码蛋白的酶活性验证,发现转AhFAD2B基因的酵母菌株有△12脂肪酸脱氢酶活性,而转AhFAD2B’基因的酵母菌株没有表现出△12脂肪酸脱氢酶活性。推测AhFAD2B’基因序列的变化可能导致了高油酸花生中△12脂肪酸脱氢酶活性的降低或失活。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1 花生产业现状及发展前景
• 1.1 国际花生产业发展现状
• 1.2 我国花生产业发展现状与产业优势
• 1.3 我国花生产业发展存在的问题及发展方向
• 2 植物油脂含量调控研究进展
• 2.1 乙酰辅酶A羧化酶
• 2.2 磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）
• 3 植物脂肪酸合成相关酶类及编码基因研究进展
• 3.1 脂肪酸的分类和功能
• 3.2 饱和脂肪酸合成相关酶类及其编码基因研究进展
• 3.3 脂肪酸去饱和酶及编码基因研究进展
• 3.4 脂肪酸延长酶及其编码基因研究进展
• 4 脂肪酸代谢的遗传调控及基因工程研究
• 4.1 脂肪酸链长度的遗传代谢调控及基因工程研究
• 4.2 脂肪酸饱和度的遗传代谢调控及基因工程研究
• 4.3 脂肪酸含量的遗传代谢调控及基因工程研究
• 4.4 新不饱脂肪酸与其基因工程研究
• 5 cDNA文库的构建
• 5.1 Oligo-capping法
• 5.2 CAPture法
• 5.3 SMART法
• 5.4 Cap-trapper法
• 5.5 CapSelect法
• 5.6 Cap-jumping法
• 6 本研究的目的和意义
• 第二章 花生幼苗全长cDNA文库的构建
• 摘要
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.2 试验方法
• 2 结果与分析
• 2.1 花生幼苗总RNA的提取和mRNA的分离
• 2.2 双链cDNA的合成
• 2.3 Sfi Ⅰ酶切及分级分离
• 2.4 文库质量检测
• 2.5 cDNA文库序列分析
• 3 讨论
• 第三章 花生PEPC基因家族的克隆与表达分析
• 摘要
• 1 试验材料
• 1.1 植物材料
• 1.2 菌株与主要试剂
• 1.3 PCR引物
• 2 试验方法
• 2.1 基因克隆
• 2.2 实时荧光定量PCR
• 2.3 生物信息学分析
• 3 结果与分析
• 3.1 花生PEPC基因家族的克隆与序列分析
• 3.2 AhPEPC编码蛋白的功能位点与结构功能域的预测
• 3.3 AhPEPCs蛋白质三级结构预测
• 3.4 PEPC蛋白的系统进化树
• 3.5 实时荧光定量PCR分析
• 4 讨论
• 第四章 花生KAS Ⅱ基因的克隆及表达分析
• 摘要
• 1 试验材料
• 2 试验方法
• 2.1 总RNA的提取及cDNA的合成
• 2.2 KASⅡ基因5’、3’-引物设计与PCR扩增、克隆与测序
• 2.3 KASⅡ基因完整编码区的获得及序列分析
• 2.4 实时荧光定量PCR分析
• 3 结果分析
• 3.1 KASⅡ基因的测序结果与序列的同源性分析
• 3.2 编码氨基酸序列同源性分析与系统进化分析
• 3.3 编码蛋白质的基本物理化学性质预测
• 3.4 编码蛋白质的功能位点与结构域预测
• 3.5 蛋白质结构预测
• 3.6 实时荧光定量PCR分析
• 4 讨论
• 第五章 花生SAD基因的克隆及表达分析
• 摘要
• 1 试验材料
• 2 试验方法
• 2.1 总RNA的提取及cDNA的合成
• 2.2 SAD基因完整编码区的引物设计与PCR扩增、克隆与测序
• 2.3 包含SAD基因完整编码区序列的分析
• 2.4 实时荧光定量PCR分析
• 3 结果分析
• 3.1 SAD基因的测序结果与序列的同源性分析
• 3.2 编码蛋白质的基本物理化学性质预测
• 3.3 编码蛋白质的功能位点与结构域分析
• 3.4 蛋白质结构预测
• 3.5 系统进化分析
• 3.6 实时荧光定量PCR分析
• 4 讨论
• 第六章 花生FAD2B基因与高油酸性状的关系
• 摘要
• 1 试验材料
• 1.1 植物材料
• 1.2 菌株与主要试剂
• 1.3 PCR引物
• 2 试验方法
• 2.1 基因克隆
• 2.2 生物信息学分析
• 2.3 酿酒酵母表达载体的构建
• 2.4 醋酸锂法转化酵母
• 2.5 酵母酿酒酵母工程菌的转化及阳性克隆的鉴定
• 2.6 酵母工程菌的表达及产物制备
• 2.7 酵母工程菌脂肪酸的气相色谱（GC）分析
• 3 结果与分析
• 3.1 高油酸花生△12脂肪酸脱氢酶基因的克隆及序列分析
• 3.2 花生△12-脂肪酸脱氢酶基因的表达特性
• 3.3 表达载体的构建及阳性克隆的鉴定
• 3.4 花生△12脂肪酸脱氢酶基因在酿酒酵母中的表达及产物分析
• 4 讨论
• 全文结论
• 参考文献
• 攻读博士期间发表的研究论文
• 致谢