物理刺激下肥大细胞的响应以及液体混合物的有效质量密度

论文摘要

针灸是一种安全、方便并且费用低廉的疾病治疗手段，对多种疾病均呈现出良好的疗效，正在得到越来越多的西方国家的承认。随着现代科学技术的进步，针灸也在不断地发展，例如激光针灸就是一个很好的例子。然而，不论是传统的针灸，还是新兴的激光针灸，在走向世界的道路上步履维艰，其中一个主要原因就是其内在治疗机制尚不清楚。在针灸作用机理研究中，肥大细胞受到很多人的关注。既往的研究发现，穴位点有大量的肥大细胞和钙元素的富集，当针刺穴位点时，观察到肥大细胞脱颗粒增加，而在针刺镇痛的大鼠实验中，当以肥大细胞膜稳定剂色甘酸钠阻断了肥大细胞脱颗粒时，镇痛作用减弱，这些均表明，肥大细胞和钙与针灸作用间存在着联系。但到目前为止，还缺乏直接的证据证明激光、机械作用等能诱导肥大细胞脱颗粒。传统针刺过程中均伴随有提插捻转等手法，如果单纯留针而不做手法，针刺效果则不佳。这些手法实质上是提供一个剪切作用，而小仅仅是留针的静压力。基于此，本文利用扫描共聚焦显微镜和荧光光谱方法，研究了激光照射和剪切应力作用对RBL-2H3肥大细胞胞内钙离子浓度及其脱颗粒释放组胺的影响，并对作用机制进行了探讨。另外，由于肥大细胞脱颗粒释放组胺，组胺的扩血管作用导致血浆渗出进入组织间隙增加，加之部分细胞破裂胞内液溢出进入组织间隙，改变了组织间液的组成，这势必影响组织液的流动特性。所以，我们选择了有效质量密度来研究液体混合后的变化情况。具体如下：首先，将RBL-2H3肥大细胞与钙荧光试剂Fluo-3／AM共孵育，再将刺激激光经共聚焦显微镜聚焦后照射于单个细胞，1min后观察胞内钙离子浓度的变化，发现该细胞胞内钙离子浓度明显升高，其浓度比照射前升高了56.6％。在组胺含量研究中，对96孔板中的RBL-2H3细胞采用不同时间和不同强度的激光照射后，取胞外上清液与邻苯二甲醛（OPA）混合反应，并测其荧光光谱，光谱反映出RBL-2H3脱颗粒释放的组胺含量增加，并具有明显的量效关系。在本实验中所使用的照射功率和时间范围内的激光对RBL-2H3细胞活力没有影响，表明组胺释放并非细胞胞膜破裂而泻露出来的。因此，激光照射能引起RBL-2H3细胞胞内钙离子浓度升高，引起细胞脱颗粒释放组胺增加。其次，在RBL-2H3肥大细胞对剪切应力的响应研究中，采用板板流室施加剪切应力，观察胞内钙离子和组胺释放的变化情况。结果表明，在剪切应力作用下，胞内钙离子荧光强度逐渐升高并趋于稳定，胞内钙离子的增高有赖于胞外一定浓度的钙离子的存在，当胞外液中不含有钙离子时，剪切作用不再升高胞内钙离子，说明胞内钙离子的升高是胞外钙离子内流的结果，和激光照射的结果一致。采用激光照射实验中同样的方法测其荧光光谱，发现剪切作用也可以诱使RBL-2H3细胞脱颗粒释放组胺，组胺的释放与剪切应力呈量效关系。第三，对胞内钙离子浓度变化及其脱颗粒组胺释放的激光照射和剪切力作用机制进行了对比。理论计算表明，激光光压和剪切作用力的大小相差悬殊(单个细胞受到的剪切作用力在pN水平，而激光光压在10-5pN，二者相差5个数量级)，因此激光照射使RBL-2H3脱颗粒的机制并非激光光压所致。为了深入研究激光作用下RBL-2H3细胞的响应机制，实验中采用免疫细胞化学方法，将培养好的RBL-2H3细胞与Ⅰ抗、Ⅱ抗顺序孵育后观察TRPV4的表达。结果证实，RBL-2H3细胞胞膜（也包括核膜）上有大量的TRPV4通道表达。TRPV4通道是介导多种物理、化学刺激的非选择性阳离子通道，尤其对钙离子的通透性较高，因此TRPV4通道很可能是一个介导激光、剪切应力作用的靶点。然后，对TRPV4通道是否参与RBL-2H3细胞对激光和剪切作用的响应进行了研究。实验中先在胞外液中添加对TRPV4通道有阻断作用的Ruthenium Red（RR）对RBL-2H3细胞进行预处理，再对细胞进行激光照射和剪切作用时发现组胺释放均被抑制，释放不再增加，并且RR的抑制作用呈剂量依赖性。因此研究认为TRPV4参与了上述两种刺激的作用，并且作用途径为：在激光照射和剪切应力的作用下，TRPV4通道开放，胞外钙离子内流从而使胞内钙离子浓度升高，钙离子浓度升高后又导致RBL-2H3脱颗粒释放组胺。最后，由于肥大细胞脱颗粒释放组胺，组胺的扩血管作用导致血浆渗出进入组织间隙增加，加之部分细胞破裂胞内液溢出进入组织间隙，和组织液混合后，组织液的流动特性将发生变化。所以，我们选择了有效质量密度来研究液体混合后的变化情况。从有效介质理论出发提出了预测液—液混合物有效质量密度的新方法，包括实验和理论拟合。先选定3种可以互溶的液体（水、乙醇和DMSO），将3种液体按不同的质量比两两混合，测定混合后的有效质量密度，或者先固定一种液体的质量比不变，改变另两种液体的质量比，测定混合后的有效质量密度。再从有效介质理论出发，将Maxwell-Gamett方程和Bruggeman方程进行一定的形式变换，在此基础上，通过类比的方法，提出预测液—液混合物密度的新方程（针对二元体系有3个方程，三元体系有4个）。在新方程中，引入了一个有效介质参数d，它是一个唯象参量，不仅与实验时的条件有关，还受液—液混合物中各组分化学性质的影响，组分不同，d值也不同。然后，利用新方程和传统的VAMD方程对实验结果进行拟合。在新方程的拟合中，对于一组实验值，先任意选定其中一个值，代入新方程中计算出d值，再将d值代回方程计算其余各点（同一组实验数据对不同的方程采用相同的d值），并与传统的VAMD拟合结果进行比较。结果发现，对液液混合物来说，基于有效介质理论的新的方程的拟合结果与实验值非常接近，明显优于VAMD的拟合结果。因此，该新方程可以正确预测液—液混合物有效质量密度。因此，激光和剪切应力等物理刺激作用于肥大细胞，通过TRP通道的开放，胞外钙离子内流，引起胞内钙离子浓度的升高，进而导致肥大细胞脱颗粒，释放组胺等生物活性物质，调节机体的功能。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 概述
• 1.1 针灸经络
• 1.2 肥大细胞的形成及其分布
• 1.2.1 形成及其分布[20]
• 1.2.2 MC脱颗粒及其循环
• 1.2.3 肥大细胞与针灸效应的关系
• 1.3 组胺的释放、测定及生物效应
• 1.3.1 组胺的释放
• 1.3.2 组胺的测定[33]
• 1.4 细胞的钙调节
• 1.4.1 胞内钙稳态
• 2+变化的时空多样性'>1.4.2 胞内CA²⁺变化的时空多样性
• 1.4.3 胞内钙离子的荧光测定法
• 1.5 激光扫描共聚焦显微镜
• 1.5.1 成像原理
• 1.5.2 优点和特点
• 1.6 本论文的主要工作
• 第二章 激光照射对肥大细胞的影响
• 2.1 前言
• 2.2 材料和方法
• 2.2.1 实验仪器
• 2.2.2 样品池
• 2.2.3 试剂及配制
• 2.2.4 实验方法
• 2.3 实验结果
• 2.4 讨论
• 本章小结
• 第三章 剪切应力对肥大细胞的影响
• 3.1 前言
• 3.1.1 细胞对机械力的响应
• 3.1.2 细胞机械力加载方法
• 3.2 材料和方法
• 3.2.1 剪切力的加载
• 3.2.2 组胺的测定
• 3.2.3 细胞活力测定
• 3.2.4 统计学方法
• 3.3 实验结果
• 3.4 讨论
• 本章小结
• 第四章 机制探讨
• 4.1 肥大细胞上的 TRP通道
• 4.1.1 TRP通道的发现
• 4.1.2 TRP通道的分类
• 4.1.3 TRP通道的结构和功能
• 4.1.4 TRPV4的功能
• 4.1.4.1 TRPV4的发现和分布
• 4.1.4.2 TRPV4的激动剂和阻断剂
• 4.1.4.3 TRPV4与物理刺激
• 4.1.5 肥大细胞上的 TRP
• 4.2 实验方法
• 4.3 实验结果
• 4.4 讨论
• 本章小结
• 第五章 液—液混合物的有效密度测定及理论拟合
• 5.1 前言
• 5.2 实验方法
• 5.3 有效介电常数的理论推导
• 5.3.1 Maxwell-Garnett理论
• 5.3.2 Bruggeman理论
• 5.4 有效质量密度的理论拟合
• 5.4.1 二元体系
• 5.4.2 三元体系
• 5.5 实验和理论结果的比较
• 5.5.1 二元体系
• 5.5.2 三元体系
• 5.6 讨论
• 本章小结
• 总结
• 参考文献
• 攻读博士学位期间发表的论文
• 致谢