昆虫病原真菌金龟子绿僵菌酸性海藻糖酶分离纯化、特性及其基因克隆的研究

论文摘要

金龟子绿僵菌（Metarhizium anisopliae）是一类应用广泛的昆虫病原真菌,在昆虫防治中起着重要作用。与化学农药相比,真菌杀虫剂尽管安全,无环境污染,但存在着杀虫速率缓慢的弱点,这在很大程度上阻碍了真菌杀虫剂的应用。对昆虫病原真菌致病机制进行研究可为发展新型高效真菌杀虫剂提供依据。海藻糖是一种非还原性二糖,存在于所有已知种类的昆虫中,是昆虫血淋巴中主要的糖类（大约占80-90%）;海藻糖在昆虫血液生理中起着重要的作用,其耗竭可能对昆虫起着致命性的作用。虫生真菌侵染进入昆虫血腔后,昆虫血淋巴中的海藻糖成为真菌生长潜在和必需的营养物质。但海藻糖对许多真菌来说是非渗透性二糖,必须在相应的二糖水解酶作用下分解为葡萄糖才能被真菌利用。金龟子绿僵菌侵染进入昆虫血淋巴后,能分泌酸性海藻糖酶,有效地降解昆虫血淋巴中的海藻糖。酸性海藻糖酶在真菌对昆虫的致病过程中起着重要的作用。目前对真菌酸性海藻糖酶的研究较少,只有少数几个物种中酸性海藻糖酶基因被克隆并测定序列。研究发现酸性海藻糖酶与中性海藻糖酶之间不具同源性,并且不同酸性海藻糖酶基因之间序列同源性很差。这为酸性海藻糖酶的研究增加了难度。在虫生真菌中,还未见酸性海藻糖酶基因克隆方面的报道。本研究以金龟子绿僵菌（M. anisopliae）菌株CQMa102和东亚飞蝗为研究材料,对绿僵菌酸性海藻糖酶培养条件和同工酶进行了系统的研究,并在此基础上采用离子交换、分子筛层析等技术手段分离纯化出绿僵菌酸性海藻糖酶蛋白,对其分子量、等电点以及其它酶学特性进行了详细的研究。在纯化的蛋白氨基酸测序的基础上,通过设计寡核苷酸探针,对构建的绿僵菌基因组文库和随后的亚克隆进行了放射性同位素筛选,结合RACE等技术手段,成功分离出绿僵菌酸性海藻糖酶基因并登录NCBI的GenBank,登录号为:DQ237957 （基因组序列）, DQ237958 （cDNA序列）。同时对绿僵菌酸性海藻糖酶在真菌侵染过程中的作用进行了较为详细的研究。研究的结果为进一步利用基因工程手段改造病原真菌、提高生物防治效果奠定了基础。主要研究结果如下:1.利用产物（葡萄糖）测定法,以酶活和同工酶为指标,筛选出适合CQMa102酸性海藻糖酶产酶的培养基和产酶条件如下:培养基:1.0g/L KH2PO4,0.5g/L MgSO4,1.0g/L KCl,10g/L可溶性淀粉,5g/L蛋白胨,5g/L酵母浸膏,pH值调至6.0。把1.0ml 1.0-3.0×107个/ml CQMa102孢子悬液接种到100ml上述培养基中,在26℃、150rpm的条件下振荡培养3天,海藻糖水解酶总活性可达到14.125U/L,比活可达到0.4344U/mg。在该培养条件下,绿僵菌产生两种海藻糖降解酶同工酶,其中一个等电点为8.4,而另一个为4.7。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 绪论
• 1.1 引言
• 1.2 研究背景
• 1.3 立题依据
• 1.4 本研究的目标和内容
• 1.5 整体设计思路
• 1.6 创新之处
• 2 金龟子绿僵菌海藻糖降解酶诱导培养条件的优化
• 2.1 技术路线
• 2.2 材料与方法
• 2.3 结果与分析
• 3 金龟子绿僵菌酸性海藻糖酶蛋白分离纯化及其特性分析
• 3.1 技术路线
• 3.2 材料和方法
• 3.3 结果与分析
• 4. 金龟子绿僵菌酸性海藻糖酶基因（ATM1）的克隆及分析
• 4.1 技术路线
• 4.2 材料与方法
• 4.3 结果与分析
• 5 金龟子绿僵菌酸性海藻糖酶在真菌侵染过程中的作用分析
• 5.1 技术路线
• 5.2 材料与方法
• 5.3 结果与分析
• 6 讨论
• 6.1 绿僵菌酸性海藻糖酶诱导培养条件的优化
• 6.2 绿僵菌酸性海藻糖酶的定位
• 6.3 金龟子酸性海藻糖酶分离纯化及纯化中存在的问题
• 6.4 金龟子绿僵菌酸性海藻糖酶学特性分析
• 6.5 金龟子绿僵菌酸性海藻糖酶末端氨基酸序列分析和多肽片断MS//MS 序列分析
• 6.6 酸性海藻糖酶基因克隆策略
• 6.7 基因组文库及亚克隆放射性同位素筛选策略
• 6.8 金龟子绿僵菌酸性海藻糖酶基因结构分析
• 6.9 酸性海藻糖酶在绿僵菌侵染中的生物学功能分析
• 7 结论及展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录