闫高波（辽宁省丹东市中心医院检验科辽宁丹东118002）
【中图分类号】R378.1【文献标识码】A【文章编号】1672-5085（2012）23-0061-02
【摘要】目的通过研究鲍曼不动杆菌生物膜与耐药性的关系，为防治因鲍曼不动杆菌造成的感染提供理论依据。方法对临床导管标本分离的鲍曼不动杆菌进行鉴定，采用刚果红培养基筛选鲍曼不动杆菌生物膜的模式菌株，并观察导管材料表面形成的生物膜结构。结果刚果红法检测能够形成生物膜的鲍曼不动杆菌的模式菌株阳性率68.0%（17/25）；扫描电镜观察到细菌聚集，由纤维素样物质交联，甚至堆积，耐药株发现温和噬菌体。结论鲍曼不动杆菌在导管中因产生生物膜，形成屏障导致对抗生素耐药；耐药株菌体表面的温和噬菌体可在耐药性传递中发挥作用。
【关键词】鲍曼不动杆菌生物膜耐药性
1资料与方法
1.1材料
细菌来源标本分别来自丹东市中心医院检验科的尿、痰、气管吸出物、血液、脑脊液等，共收集100例标本（见表1）。首先涂片，革兰染色，镜检，可疑菌进行分离培养。其中血液和脑脊液标本首先进行LB肉汤增菌培养，标本接种于中国蓝平板42℃培养过夜，青霉素·诺氟沙星平板37℃培养过夜，可疑菌落于中国蓝培养基中纯化，得到的纯化菌株经生物一梅里埃公司ATB细菌鉴定仪鉴定到种。
1.2主要试剂及仪器
1.2.1试剂刚果红培养基：刚果红（国产分析纯），自制牛心脑浸液干粉，琼脂粉（汕头达豫精细化学品公司），蔗糖（北京化学试剂二厂）按文献[4]配制；ID32GN革兰阴性杆菌鉴定试条（Ref.32100）试剂条；
1.2.2仪器生物梅里埃ATB细菌鉴定仪，Innova40震荡培养箱。Nikon80I显微镜，离心机Sigma1-14，
1.3方法
1.3.1菌种鉴定
1初步鉴定直接涂片革兰染色；氧化酶、硝酸盐还原试验、动力实验阴性
2）菌种鉴定采用ATB生化鉴定分析仪，按ID32GN革兰阴性杆菌鉴定试条（Ref.32100）说明书进行鉴定。
1.3.2生物膜定性
1）选择已提纯的鲍曼不动杆菌菌落接种于刚果红培养基上，37℃培养一周左右，形成生物膜的菌落变为棕黑色，不形成生物膜的菌落仍为白色。
2）将经过初步确定可形成生物膜的菌株接种于LB肉汤中，调细菌终浓度为0.5麦氏单位，同时设阴性对照组为枯草杆菌（0.5麦氏单位），阳性对照组ATCC19606（0.5麦氏单位）；肉汤对照组、生理盐水对照组为空白对照组。无菌条件下将临床常用的一次性硅胶导管圆片（经过高压灭菌），直径5mm，浸入其菌液中，封口膜封口防止污染
37℃培养，Innova40温控摇床震荡，振幅为50Hz，每隔24h取出，用盐水冲洗，除去浮游菌，换新培养液，持续7d。取出导管片用无菌生理盐水2ml反复冲洗3-5次，洗去浮游菌，置于2.5%戊二醛溶液中于4℃冰箱固定24h，以PH7.2的磷酸盐缓冲液冲洗3次，每次10min，再以1%的锇酸4℃固定2h，4℃双蒸水冲洗3次，梯度乙醇脱水（以50%、70%、80%、90%、95%两次、100%三次，每次脱水时间10min），醋酸异戊酯置换，CO2临界点干燥，离子喷金镀膜，通过KYKY-3200SEM进行观察。
1.3.3鲍曼不动杆菌超微结构的观察。
2结果
2.1菌种鉴定
鲍曼不动杆菌革兰染色为阴性球杆菌，多为成对排列；无芽胞、无鞭毛，较难脱色，氧化酶、硝酸盐还原试验、动力试验阴性。
100例临床标本中分离出鲍曼不动杆菌25株，ATB生化鉴定菌株：纯度为99.9%。
表1标本来源
2.225株鲍曼不动杆菌中有17例在刚果红培养基上形成黑色菌落。为生物膜的模式菌株，阳性率为68.0%。另8株菌在刚果红培养基培养，菌落始终为无色。
2.3鲍曼不动杆菌的耐药情况：
表2鲍曼不动杆菌耐药性检测
表注：鲍曼不动杆菌杆菌的耐药率：84.0%（21/25）
2.4.鲍曼不动杆菌形成的生物膜（图1）
A鲍曼菌培养3dB鲍曼菌培养5d
C鲍曼菌培养7dD枯草杆菌阴性对照
图1
扫描电镜显示：A、B、C图表明随培养时间延长，生物膜中细菌逐渐减少，但膜内纤维素样分泌物增多，D图阴性对照组枯草芽胞杆菌未见生物膜形成。
2.5扫描电镜（S-4800）下可见鲍曼不动杆菌表面有温和噬菌体存在。（见图2）
图2扫描电镜下耐药株具有温和噬菌体呈蟹壳形，敏感株无温和噬菌体。
3讨论
本实验取自ICU病房和普通病房的100例标本中，取自气管吸出物67例，取自痰标本17例，可见呼吸道感染合计84例（84.0%）；100例标本中分离出25株鲍曼不动杆菌，其中有21株耐青霉素·诺氟沙星，17株能形成生物膜，而且鲍曼不动杆菌的耐药率为84.0%（21/25）（见表2），如此强耐药率，急需快速、便捷的方法监测耐药性的变化。
鲍曼不动杆菌具有泛耐药性的特征[1]，由于ICU患者病情重，各种侵入型引流管多，这些导管因与外界相通，为细菌定植提供了机会，当细菌定植于导管，在导管内的气体或液体的流动冲刷下，容易形成生物膜（17/25）。图1可见：3d开始形成生物膜，5d生物膜成熟，7d生物膜明显增厚。细菌聚集，由纤维素样物质交联，甚至堆积，说明鲍曼不动杆菌可在医用导管内定植并形成生物膜，是鲍曼不动杆菌高感染率的重要原因，可能是鲍曼不动杆菌高耐药性的原因之一。本研究中分离的鲍曼耐药的菌株在电镜下可见温和噬菌体，细菌表面光滑，无损坏。推测耐药性是通过转导、溶原性转换或者水平基因转移[2,3]获得，但需继续研究。
参考文献
[1]欧阳萍，黄晶，雷连成，等.全耐药鲍曼不动杆菌分子分型和分子流行病学调查[J].生物技术通报，2009，10：161-164.
[2]RamadassBalamurugan,V.Balaji&BalakrishnanS.Ramakrishna.EstimationoffaecalcarriageofClostridiumdifficileinpatientswithulcerativecolitisusingrealtimepolymerasechainreactionJ.IndianJ.MedRes2008,127,pp472-477.
[3]王秋实，李彤，刘玉村.一种院内感染机会致病菌－不动杆菌[J].中国病原生物学杂志，2008，3（4）：315-317.