SARS病人组织中SARS冠状病毒全基因组克隆、序列分析及病毒样颗粒装配

论文题目: SARS病人组织中SARS冠状病毒全基因组克隆、序列分析及病毒样颗粒装配

论文类型: 博士论文

论文专业: 预防兽医学

作者: 杨仁全

导师: 陈溥言,王健伟

关键词: 冠状病毒,分离,克隆,组装,病毒样颗粒

文献来源: 南京农业大学

发表年度: 2005

论文摘要: 2003年春季在我国广东、北京等地人群中爆发了以高热、寒战、肌肉痛、干咳、呼吸困难、高度接触性传染为主要特点的传染性疾病，随后该疾病被正式命名为“严重急性呼吸综合症(简称SARS)”。病因学研究表明，SARS的病因是一种新型冠状病毒，世界卫生组织将其命名为SARS相关冠状病毒(SARS-associated coronavirus，SARS-CoV)。作为一种新发现的病毒，目前对其遗传学和复制、装配机制等还所知甚少，因此开展此方面研究具有重要意义。笔者参与了SARS病原的调查工作。为深入阐明北京地区流行的SARA-CoV的病原学特征，首先从SARS病人病料标本中进行病毒分离试验。将SARS病人临床标本，如咽拭子、痰液和肺组织标本接种Vero细胞，连续传代后，可观察到显著的细胞病理改变(CPE)，表明可能标本中可能存在病毒。电镜观察分离物培养上清负染样本，，可见到形态与典型冠状病毒外观相似的病毒样颗粒；用SARS病人康复期血清进行的间接免疫荧光试验，显示分离物接种培养的细胞胞浆内存在特异性荧光，证实培养物中存在与SARS-CoV相关的病毒抗原；提取分离物总RNA进行RT-PCR检测，可用冠状病毒基因组序列特异性引物扩增特异性片段，克隆扩增片段后进行DNA序列分析，结果显示所扩增的片段为冠状病毒保守的复制酶基因区序列。因此综合以上结果，提示分离到的病毒为SASR冠状病毒为比较来源于SARS病人人体组织和已经分离、培养的SARS-CoV基因组之间的差异，阐明病毒的遗传和变异特点并深入探讨其致病机制，利用RT-PCR从北京地区一例SARS死亡病人(#5)肺组织总RNA中对SARS-CoV组织毒的基因组全长cDNA进行了克隆和序列分析。参考已经发表的SARS-CoV全序列，将待测定的SARS-CoV全长基因组分成26个片段，设计引物进行扩增。扩增并克隆的26个目的片段覆盖SARS-CoV全长基因组。测序结果表明本次实验中SARS-CoV-5#毒株基因组全长29707个核苷酸。同源性比对结果表明，SARS-CoV组织毒5#基因组序列与BJ01-BJ04地方分离株为同一流行株型。本次试验测定的组织毒的基因组序列在基因组水平上与18株全序列已知人源毒株的碱基差异不明显，而与10株动物来源的SARS-CoV分离株全序列在92个核酸位点上存在明显差异，这说明人源SARS-CoV毒株的全序列与动物源SARS-CoV毒株的全序列存在基因组水平的碱基差异，而细胞培养和人体组织来源的SARS毒株不存在基因组水平的碱基差异。对各种来源的SARS病毒的S蛋白质基因分析同样也显示了类似的碱基差异

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摘要

ABSTRACT

第一章 SARS冠状病毒分子生物学进展

一 SARS-CoV基因组学研究进展

二 SARS-CoV非结构蛋白质分子生物学研究进展

1.2.1 SARS-CoV多聚蛋白的RNA加工酶类似物

1.2.2 SARS-CoV特异蛋白酶

1.2.2.1 SARS-CoV的PL2~(pro)酶

1.2.2.2 SARS-CoV的3CL~(pro)蛋白酶

1.2.3 SARS-CoV的其他非结构蛋白质

三 SARS-CoV主要结构蛋白质分子生物学

1.3.1 SARS-CoV S蛋白质分子生物学

1.3.1.1 S蛋白质概述

1.3.1.2 S蛋白质受体结合功能与SARS-CoV的受体

1.3.1.3 S蛋白质与膜融合

1.3.1.4 S蛋白质分子免疫学和膜融合抑制肽

1.3.1.5 S蛋白质其他细胞生理效应

1.3.2 SARS-CoV N蛋白质分子生物学和分子免疫学

1.3.2.1 SARS-CoV N蛋白质分子生物学

1.3.2.2 SARS-CoV N蛋白质分子免疫学

1.3.3 SARS-CoV E蛋白质和M蛋白质分子生物学

1.3.3.1 SARS-CoV E蛋白质分子生物学

1.3.3.2 SARS-CoV M蛋白质分子生物学

四抗SARS-CoV疫苗及抗病毒药物研究

1.4.1 SARS-CoV疫苗

1.4.1.1 SARS-CoV灭活病毒疫苗

1.4.1.2 SARS-CoV重组蛋白质疫苗与SARS-CoV病毒感染抑制性肽

1.4.1.3 SARS-CoV DNA疫苗

1.4.1.4 SARS-CoV DNA免疫与SARS病毒蛋白质疫苗联合应用

1.4.1.5 SARS-CoV重组活载体疫苗

1.4.2 干扰素和小分子治疗药物

1.4.2.1 干扰素

1.4.2.2 小分子治疗药物

五 SARS-CoV动物感染试验模型

六结语

七本章参考文献

第二章 SARS冠状病毒的分离培养和鉴定

一、材料和方法

2.1 材料

2.1.1 病毒分离标本和分离细胞

2.1.2 试剂、载体、实验仪器和实验场所

2.2 方法

2.2.1 病毒的细胞分离培养

2.2.2 细胞分离物的收获

2.2.3 病毒培养物鉴定

2.2.4 套式RT-PCR鉴定SASR-CoV特异性病毒RNA

2.2.5 特异性扩增片段的回收克隆和测序

2.2.6 病毒的滴定

二、结果

1.病料接种培养的Vero细胞产生CPE现象

2.电镜观察到感染细胞培养上清中存在冠状病毒样粒子

3.病料接种Vero培养细胞与SARS病人康复期血清特异性结合

4.SARS-CoV病毒特异性核酸序列分析结果

5.分离的SARS-CoV病毒滴度一时间变化关系

三、讨论

四、小结

五、参考文献

第三章 SARS病人肺组织中SARS-COV全基因组CDNA克隆及序列分析

一、材料与方法

3.1 材料

3.1.1 RNA模板

3.1.2 克隆引物

3.1.3 PCR仪、工具酶和其他分子生物学常用试剂

3.2 方法

3.2.1 RNA模板提取

3.2.2 SARS-CoV-5#全基因组cDNA克隆

二结果

1.目的片段的克隆和重组质粒初步PCR鉴定

2.SARS-CoV-5#全基因组cDNA克隆测序

三、讨论

四、本章小结

五、参考文献

六、本章附录

1 本章附表

2.本章附录链接地址

3.SARS-CoV-5#测序结果

第四章 SARS冠状病毒结构蛋白质基因的表达及其病毒样颗粒的包装试验

一材料和方法

4.1.1 材料

4.1.1.1 细胞、毒株

4.1.1.2 试剂和抗体

4.1.2 方法

4.1.2.1 末端重叠拼接PCR法.人工合成密码子优化SASR-CoV结构蛋白质E基因

4.1.2.2 末端重叠拼接PCR人工合成密码子优化SASR-CoV结构蛋白质M基因

4.1.2.3 完整M基因组装和测序

4.1.2.4 PCR方法在M基因C末端引入肽标签FLAG

4.1.2.5 表达SARS-CoV主要结构蛋白质基因重组杆状病毒载体的构建

4.1.2.6 重组冠状病毒的包装和滴定

4.1.2.7 感染重组杆状病毒的细胞内SARS-CoV结构蛋白质基因表达的检测

4.1.2.8 重组杆状病毒感染Sf9细胞形成细胞内SARS-CoV VLP

二、结果

1 优化密码子合成的M、E基因的鉴定

2 含SARS-CoV结构蛋白质基因杆状病毒重组转座质粒的构建

3 表达SARS-CoV结构蛋白质的重组杆状病毒的获得与鉴定

1) 重组杆状病毒基因组Bacmid的PCR鉴定

2) 重组杆状病毒基因组Bacmid细胞转染包装病毒

3) 重组杆状病毒表达SARS-CoV结构蛋白质的检测

4 SARS-CoV VLP的装配

三、讨论

四、本章小结

五、参考文献

六、本章附录

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致谢

发布时间: 2006-10-20

参考文献

[1].ACE2基因变异与SARS冠状病毒进入及肺部病变严重程度之间的关系研究[D]. 陈云新.中国协和医科大学2008
[2].SARS-CoV M蛋白的RNA干扰研究及三个保守的组氨酸残基在SFV感染中的作用[D]. 秦照玲.第二军医大学2008
[3].胡宁病毒核蛋白结构与功能的研究[D]. 张寅杰.南开大学2013
[4].蛋白激酶NEK6调控细胞抗病毒信号转导机制及DNAzyme抗病毒活性研究[D]. 吴叔文.武汉大学2012
[5].一、Spike蛋白来源B细胞表位多肽及抗体在SARS冠状病毒感染中作用机制研究二、EV71病毒基因工程亚单位疫苗的制备及鉴定[D]. 贾春实.中国协和医科大学2009
[6].病毒衣壳相关蛋白抑制宿主细胞凋亡与RNA沉默的分子机制研究[D]. 崔蕾.武汉大学2014

SARS病人组织中SARS冠状病毒全基因组克隆、序列分析及病毒样颗粒装配

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