天花粉蛋白新有效组分的纯化、一级结构及免疫调节和抗肿瘤活性研究

论文摘要

天花粉蛋白（Trichosanthin,TCS）是从葫芦科栝楼属植物栝楼（Trichosanthes kirilowii）的块根中提取的一组有效组分,它包含一系列分子量不同的蛋白质。目前已知的天花粉蛋白均是单一多肽链的碱性蛋白,属于Ⅰ型核糖体失活蛋白（Ribosome-Inactivating Protein,RIP）。目前,对天花粉蛋白针剂的结构和功能的研究已很深入。天花粉蛋白针剂分子量约26KD,蛋白呈碱性,等电点为9.4,由247个氨基酸残基所组成,分子中不含半胱氨酸,因此不存在二硫键的双链结构。除可用于中期妊娠引产及宫外孕、葡萄胎、腹腔妊娠等疾病的治疗外,近几年发现天花粉蛋白针剂还具有免疫调节功能,抗肿瘤及抗病毒活性。同时也发现其具有肾毒性及免疫原性,易产生过敏及类过敏反应,影响了其在临床的应用。针对以上问题,本研究采用一系列生化方法从野生型及人工培植型新鲜栝楼块根中分离纯化天花粉蛋白新有效组分,分别对其相对分子质量及N-端氨基酸序列进行测定,并与天花粉蛋白针剂及其同源性较高的蛋白进行比较。同时,研究其免疫调节活性及抗肿瘤活性和致敏作用。旨在了解天花粉蛋白新有效组分的结构、生物活性及免疫原性,探讨其临床应用价值。本研究的结果及创新之处在于:1.采用一系列生化方法分别从野生型及人工培植型新鲜栝楼块根中分离纯化出天花粉蛋白新有效组分,建立了一套操作简便、周期短、产率高的纯化方法。并通过对两者的比较发现,植物的培育方式、培植条件不同,所提纯的有效组分的产率亦不同,其中从野生型新鲜栝楼块根纯化天花粉蛋白新有效组分的产率为1.2mg·g-1。从人工培植型新鲜栝楼块根纯化天花粉蛋白新有效组分的产率为0.3mg·g-1。目前国内尚未见类似报道。2.采用LDI-1700激光解吸电离飞行时间质谱仪及ABI PROCISETM492cLC型蛋白质测序仪测定分别从野生型及人工培植型新鲜栝楼块根中分离纯化出的天花粉蛋白新有效组分的相对分子质量分别为33388.9及32116,N-端氨基酸序列分别为D-C-P-S-F-D-L-S-T-A-T-Q-D-S-Y-A-S-F-I-T-P-L-A及D-C-P-S-F-D-L-S-T-A-T-Q-D-S-Y-A-S-F-I-T。在国内外首次发现其一级结构中含有半胱氨酸,与天花粉蛋白针剂及TAP29（从美国产的栝楼中纯化出的一种新的天花粉抗HIV蛋白）的一级结构明显不同,对NCBI数据库进行检索,未发现有相同的序列存在,提示该两种成分可能是新的蛋白质。3.在国内外首次应用流式细胞仪检测天花粉蛋白新有效组分及天花粉蛋白针剂分别免疫C57BL/6小鼠后,小鼠各淋巴器官CD4+CD25+T细胞的百分比,发现小鼠胸腺及外周淋巴器官脾脏均出现CD4+CD25+T细胞水平升高,提示天花粉蛋白新有效组分可能通过使CD4+CD25+T细胞水平升高发挥免疫抑制作用。4.天花粉蛋白新有效组分可使小鼠黑色素瘤B-16细胞的G0/G1期细胞增多,而S期细胞减少,呈现明显的G0/G1期阻滞现象,且这种G0/G1期阻滞作用随天花粉蛋白新有效组分剂量的增加而增加。5.天花粉蛋白新有效组分中、高剂量组均可诱导小鼠黑色素瘤B-16细胞发生凋亡,且随着浓度的增大,凋亡细胞的比例也随之增加。小鼠黑色素瘤B-16细胞在天花粉蛋白新有效组分作用下,G0/G1期阻滞与细胞凋亡呈明显正相关。6.天花粉蛋白新有效组分及天花粉蛋白针剂对小鼠黑色素瘤B-16细胞增殖均有抑制作用,且随着药物浓度及作用时间的增加,对细胞增殖的抑制作用也明显增强。即天花粉蛋白新有效组分及天花粉蛋白针剂对B-16细胞的增殖抑制作用具有明显的剂量依赖性和时间依赖性,在剂量相同、作用时间相同的情况下,天花粉蛋白新有效组分致B-16细胞的增殖抑制率略高于天花粉蛋白针剂,但二者无显著性差异。7.在国内外首次发现天花粉蛋白新有效组分可以通过抑制小鼠黑色素瘤B-16细胞增殖,诱导B-16细胞凋亡起到抗肿瘤作用,且这种作用具有明显的剂量依赖性和时间依赖性,提示天花粉蛋白新有效组分有可能成为一种很有前途的抗肿瘤新药。8.在国内外首次报道了天花粉蛋白新有效组分致豚鼠全身过敏反应试验为阴性,并与天花粉蛋白针剂进行了对比,其过敏反应远小于天花粉蛋白针剂,提示天花粉蛋白新有效组分有可能成为一种毒副作用小、具有广泛用途的新型临床用药。

论文目录

• 提要
• 英文缩写词表
• 引言
• 一、天花粉蛋白的结构及基因表达
• 二、天花粉蛋白在妇产科的应用
• 三、天花粉蛋白的免疫调节作用
• （一） TCS对细胞免疫的作用
• （二） TCS对体液免疫的作用
• （三） TCS对红细胞免疫功能作用
• （四） TCS对补体的作用
• 四、天花粉蛋白的抗肿瘤作用
• 五、天花粉蛋白的抗病毒作用
• 六、天花粉蛋白的细胞毒性及免疫原性
• 研究工作
• 第一部分 天花粉蛋白新有效组分的分离纯化
• 材料与方法
• 一、材料
• 二、仪器
• 三、方法
• 结果
• 一、CM-52柱层析
• 二、SDS-PAGE
• 三、G-75柱层析
• 四、冻干
• 讨论及本研究创新之处
• 第二部分 天花粉蛋白新有效组分的相对分子质量、N-端氨基酸序列及蛋白浓度测定
• 材料与方法
• 一、材料
• 二、仪器
• 三、方法
• 结果
• 一、相对分子质量测定
• 二、转PVDF膜
• 三、N-端氨基酸序列测定
• 四、相对分子质量及N-端氨基酸序列比较
• 五、蛋白质浓度测定
• 讨论及本研究创新之处
• 第三部分 天花粉蛋白新有效组分对免疫调节细胞作用的研究
• 材料与方法
• 一、材料
• 二、仪器
• 三、方法
• 结果
• 讨论及本研究创新之处
• 第四部分 天花粉蛋白新有效组分抗肿瘤作用研究
• 材料与方法
• 一、材料
• 二、仪器
• 三、方法
• 结果
• 一、细胞周期测定
• 二、细胞凋亡测定
• 三、细胞增殖抑制测定
• 讨论及本研究创新之处
• 第五部分 天花粉蛋白新有效组分及天花粉蛋白针剂致豚鼠全身过敏反应的实验研究
• 材料与方法
• 一、材料
• 二、方法
• 结果
• 讨论及本研究创新之处
• 结论
• 参考文献
• 攻读博士学位期间发表的学术论文
• 中文摘要
• Abstract
• 致谢