论文摘要
研究背景及目的：近年来随着低温生物医学的发展，研究者已将目光逐渐从低温损伤对单细胞的影响转移到组织完整性的破坏上。细胞外基质（extracellular matrix，ECM）作为细胞生存的微环境，其任何改变都有可能通过细胞膜作用于整个细胞，进而影响其生物学性状及功能。对皮肤而言，作为活力较高的基底细胞层部分，其破坏程度将会影响整个皮片组织的活力。研究发现在皮肤基底细胞膜表面存在着一种重要的膜蛋白受体即β1整合素（β1integrin），它作为多种细胞外基质的受体，通过细胞内踝蛋白在介导细胞外基质和细胞骨架之间起着桥梁作用，同时对于维持细胞膜完整性及其活性方面可能发挥着重要意义。本课题旨在研究皮肤组织低温储存后细胞外基质成分层粘连蛋白（laminin，LN）、细胞膜表面分子β1integrin、细胞内踝蛋白（talin）的改变，同时继续探讨海藻糖（trehalose）作为低温保护剂的研究，通过其对皮肤低温损伤的干预，观察β1integrin改变，进一步揭示皮肤低温损伤机制并为完善海藻糖作为低温保护剂有效成分提供实验依据。方法：在第一部分中采用病人烧伤整形术后（4小时内）所余正常皮片，随机分为4℃组、-20℃组、-80℃组、-196℃组，设新鲜组为对照组。分别在不同的时间点进行实验观察，首先通过H.E.染色和免疫组织化学染色两种病理方法在光镜下观察基底细胞形态和蛋白的变化，采用Image-Pro5.0图像分析软件进行图像分析，研究指标包括βlintegrin、laminin、talin；其次，采用透射电镜观察基底膜的变化，并应用逆转录聚合酶链反应（reverse transcription-polymerasechain reaction RT-PCR）方法检测β1integrin基因水平表达规律。近年来海藻糖抗冻性能在低温领域得到广泛应用，为了明确其对皮肤低温储存是否发挥较传统保护剂更为优势的作用，从而达到完善皮肤抗冻剂配方的目的，在本实验第二部分中，我们继以往海藻糖对皮肤组织细胞骨架成分保护作用的基础之上，进一步采用免疫组织化学方法、RT-PCR方法观察了海藻糖对细胞膜表面分子β1integrin的作用，并分别应用透射电镜和琥珀酸脱氢酶定量检测法观察两种不同低温保护剂组合对皮肤基底膜及活力的影响。结果：从第一部分实验结果发现：1．不同低温储存皮肤后β1integrin表达规律：4℃、-20℃、-80℃、-196℃组β1integrin水平均有不同程度的下降。与新鲜对照组相比，4℃组β1integrin、laminin、talin出现显著降低，统计学结果显示，p＜0.01，而-196℃组下降程度较轻，p＞0.05。2．不同储存时间对β1integrin、laminin、talin表达的影响：其中4℃组储存情况下，各项指标随时间变化下降最为明显，其次为-20℃组，而-196℃组三种蛋白水平均略有下降，-80℃组蛋白含量则介于-196℃组、-20℃组之间。3．不同低温储存皮肤后表皮基底膜的变化规律：通过电镜观察发现-196℃组基底膜保存完整、连续性好，半桥粒结构清晰可见，4℃组可见基底膜变薄、多处出现断裂，结构模糊不清，-80℃组、-20℃组基底膜变化介于上述两者之间，且-80℃组比-20℃组基底膜保存较为完整。第二部分实验结果发现：1．通过免疫组织化学观察可见，在第7天时，T／D、D／P组β1integrin表达量与新鲜组相似。随时间延长，T／D组表现出了较传统保护剂组对β1integrin保护更为优势的作用。从RT-PCR实验结果观察，经过低温储存1周后，T／D、D／P组β1integrin表达量与新鲜组近似，随时间延长D／P组表达相对减弱，与新鲜组比较，p＜0.01。2．通过比较活力，发现随储存时间的延长，各组皮片活力呈不同程度的下降。统计分析结果显示，储存时间为2周时，T／D组、D／P组与新鲜组比较p＜0.01，而T／D组和D／P组间进行双样本t检验，p＜0.05，亦说明随时间延长T／D组皮肤活力优于D／P组。结论：β1integrin、laminin、talin在皮肤低温损伤中发生了较为明显的变化，结合这三种蛋白与细胞骨架的密切关系以及既往对细胞骨架在低温损伤中的研究基础，可推知β1integrin、laminin、talin可能在参与并介导细胞骨架对皮肤组织的低温损伤中发挥着重要的作用。在传统低温保护剂中添加海藻糖后，皮肤活力得以提高的原因体现在多方面，除了对细胞骨架的保护作用外，对膜蛋白分子β1integrin的保护作用亦是活力得以提高的重要原因。