过表达Vmp1通过调控ZO-1抑制肝细胞癌侵袭转移

论文摘要

肝细胞癌（Hepatocellular Carcinoma, HCC）是世界上最常见、高发的恶性肿瘤之一,因其高发病率、高复发转移率及高死亡率,已成为一种威胁人民生命健康的最常见的恶性肿瘤。显然,深入研究HCC复发转移的分子机制并积极探索有效的抗复发转移的治疗措施,对于进一步改善HCC患者长期存活率具有重要意义。液泡膜蛋白1（Vacuole membrane protein 1,Vmp1）是新近发现的一类跨膜蛋白,在进化中高度保守,提示其可能参与蛋白间的相互作用和跨物种的重要生命活动。近年来的研究发现Vmp1为蛋白分泌、细胞器官形成及多细胞发育过程所必需,在诸多肿瘤相关的细胞学过程（包括细胞膜运输、生长增殖、自噬等）中发挥着关键的作用,提示Vmp1可能在肿瘤发生、发展中发挥了重要作用。更重要的是,Vmp1是细胞-细胞间连接及紧密连接形成的重要成分,其在调控细胞粘附能力方面的强大功能,提示Vmp1可能参与HCC侵袭转移过程,但其作用机制目前尚不清楚。因此,本课题在研究Vmp1在临床肝癌病例及肝癌细胞系中表达情况的基础上,进一步通过质粒构建转染技术上调Vmp1的表达,并综合利用一系列体外、体内方法研究Vmp1调控HCC侵袭转移的分子机制,同时探讨上调Vmp1表达对HCC侵袭转移的影响。我们获得了如下研究结果：1、我们采用半定量RT-PCR、荧光实时定量PCR和Western blot等方法检测了Vmp1 mRNA和蛋白在38例新鲜HCC组织及相应癌旁肝组织（PCLT）、5例门静脉癌栓（PVTT）中的表达水平,结果发现Vmp1 mRNA和蛋白在HCC组织中均明显低表达,在PVTT中的表达水平最低。免疫组化法检测124例HCC组织中Vmp1的表达,结果显示Vmp1主要分布于细胞浆内及胞膜,HCC组织中Vmp1蛋白阳性表达率（81／124,65.3%）明显低于PCLT组织（108／124,87.1%）,且其表达水平与HCC的肿瘤结节数目、有无静脉浸润及有无包膜形成等临床病理特征密切相关。同时,结节性肝癌（NHCC）中的Vmp1蛋白表达水平明显低于孤立性大肝癌（SLHCC）和小肝癌（SHCC）,而在SLHCC和SHCC间其表达无明显差异。Vmp1低表达组HCC患者的无瘤生存时间及总体生存时间均明显短于Vmp1高表达组的患者,多元Cox回归模型显示Vmp1低表达是HCC预后的独立危险因素,提示Vmp1的低表达与HCC的侵袭转移密切相关,并可能因此而导致了HCC患者的不良预后。2、RT-PCR及Western blot方法检测Vmp1 mRNA和蛋白在HepG2、MHCC97-L和HCCLM3这三种侵袭转移潜能依次升高的肝癌细胞系中的表达水平,并以常氏肝细胞系CCL13作为对照。结果显示Vmp1 mRNA和蛋白在HCCLM3和MHCC97-L细胞系中的表达明显低于HepG2和CCL13细胞系,且其表达水平在HepG2、MHCC97-L、HCCLM3细胞中依次降低,提示Vmp1的低表达与肝癌细胞的侵袭转移潜能密切相关。3、我们构建了重组质粒pCMVtag2C-VMP1,使用FuGENE 6转染并经G418筛选,获得了稳定转染细胞系HCCLM3VMP1+和空质粒对照组HCCLM3vector细胞。RT-PCR和Western blot结果发现HCCLM3VMP1+细胞中Vmp1的基因和蛋白的表达被明显上调。MTT法结果显示HCCLM3VMP1+较HCCLM3vector细胞的增殖能力明显下降；划痕实验显示HCCLM3VMP1+较HCCLM3vector细胞迁移能力明显下降,Transwell侵袭实验显示HCCLM3VMP1+细胞较HCCLM3vector细胞的侵袭能力明显下降；粘附实验结果显示与HCCLM3vector细胞相比,HCCLM3VMP1+细胞的同质性粘附能力明显增强而异质性粘附能力明显减弱。这些结果提示在体外实验中上调Vmp1的表达可显著影响肝癌细胞的粘附能力而抑制其增殖、迁移、侵袭。4、为在体内观察上调Vmp1对肝癌侵袭转移的影响,我们建立了HCCLM3转移性人肝癌细胞裸鼠模型。免疫组化结果显示,HCCLM3VMP1+组种植瘤组织中Vmp1的表达水平明显高于HCCLM3vector组；测量皮下种植瘤的大小,结果显示HCCLM3VMP1+组裸鼠原位种植瘤的平均体积明显小于HCCLM3vector组；裸鼠肺组织连续切片计数肺转移的数目,结果显示体内上调Vmp1能够抑制HCCLM3细胞的肺转移能力。我们的结果提示,上调Vmp1后在体内肝癌细胞的成瘤能力和侵袭转移能力受到明显抑制。5、已有研究显示Vmp1为细胞间连接和紧密连接形成的必要成分,在相邻细胞间的斑样结构与ZO-1共同定位。我们因而推测,Vmp1是否通过对ZO-1的调节来实现其对细胞粘附能力的影响。因此,我们用免疫共沉淀法证明HCCLM3VMP1+细胞中Vmp1与ZO-1存在直接的相互作用,但Western blot显示HCCLM3VMP1+和HCCLM3vector这两种细胞中ZO-1蛋白的表达水平并无明显差异。于是我们进一步研究Vmp1对ZO-1酪氨酸磷酸化的调控,免疫沉淀及Western blot的结果显示,HCCLMSP1+细胞中ZO-1蛋白的酪氨酸磷酸化水平明显低于HCCLM3vector。这些结果提示,上调Vmp1的表达可以降低ZO-1蛋白的酪氨酸磷酸化水平,从而上调ZO-1的功能以抑制肝癌的转移。基于上述研究结果我们可以得出以下结论：Vmp1在肝癌组织中低表达,其表达水平与肿瘤结节数目、包膜形成及静脉侵犯等临床病理特征密切相关,并显著影响肝癌患者的预后。研究证明,体内外上调Vmp1的表达可显著抑制肝癌的侵袭转移。Vmp1通过调节ZO-1的酪氨酸磷酸化调控肝癌细胞的粘附能力,从而在肝癌侵袭转移中发挥重要作用。本研究提示,Vmp1可作为一个新的肝癌预后标志物和潜在的侵袭转移干预靶点。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 中英文缩略语
• 前言
• 材料与方法
• 1. 标本收集
• 2. 临床病理学研究及临床随访
• 3. 实验方法
• 3.1 半定量及荧光实时定量RT-PCR
• 3.2 Western blot
• 3.3 免疫组织化学研究
• 3.4 细胞培养
• 3.5 pCMVtag2C-VMP1质粒构建与细胞转染
• 3.6 体外细胞学实验
• 3.7 体内裸鼠成瘤实验
• 4. 统计学分析方法
• 结果
• 1. Vmp1 mRNA和蛋白在HCC组织中均呈低表达
• 2. HCC组织中Vmp1 mRNA与蛋白表达水平的相关性
• 3. Vmp1在肝癌细胞系中低表达与其侵袭转移潜能相关
• 4. Vmp1低表达与肝癌临床病理特征的关系
• 5. Vmp1低表达与肝癌患者不良预后密切相关
• 6. 重组质粒pCMVtag2C-VMP1转染HCCLM3细胞上调其Vmp1表达
• 7. 上调Vmp1表达可抑制肝癌细胞的增殖、迁移、侵袭并影响粘附能力
• 8. 上调Vmp1表达可以在体内抑制肝癌细胞的成瘤和转移
• 9. 上调Vmp1可降低ZO-1酪氨酸磷酸化而不影响ZO-1蛋白表达水平
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述
• 致谢
• 在读期间发表的论文