论文摘要
促肾上腺皮质激素释放因子（Corticotropin-releasing Factor,CRF）是由41个氨基酸组成的神经肽。是机体应激反应的关键因子,协调应激相关的自主神经、免疫、生理和行为反应。CRF是应激反应轴下丘脑-垂体-肾上腺轴（HPA轴）的起始因子,通过作用于垂体上的CRF受体1（Corticotropin-releasing Factor receptor,CRFR1）,激活HPA轴。CRF受体是典型的G蛋白偶联受体,主要有CRFR1与CRFR2两种亚型。两种受体的信号传导途径相似,以AC-cAMP-PKA信号通路为主介导生物学效应。在长期应激条件下,CRF分泌过多,HPA轴功能亢进,介导了抑郁症等情感类疾病。重症抑郁症患者脑脊液中CRF含量过高,HPA轴功能亢进;crfr1基因敲除小鼠不易表现出焦虑样行为;CRFR1拮抗剂能够拮抗动物的抑郁样行为等证据都表明CRFR1有可能成为新一代抗抑郁症的靶标。尽管CRFR1拮抗剂在动物模型中显现出良好的抗抑郁作用,但在临床试验中表现出严重的毒性反应,使此类药物的研究不得不停止。小肽类药物具有活性高,副反应小等优势,越来越受到人们的重视,目前还没有关于CRFR1小肽类拮抗剂的报道。本课题利用经典的噬菌体展示技术筛选CRFR1肽类拮抗剂,希望筛选到毒副作用小的CRFR1小肽类拮抗剂,用于抑郁症的治疗与研究。1.靶蛋白序列的分析和确定:CRFR1为典型的B1超家族G蛋白偶联受体,七次跨膜,N端位于细胞外,C端位于细胞内。CRFR1 EC1区是CRF及相关肽结合的关键区域,其中包含形成CRFR1结合构象的区域（Q43-N90）和CRFR1的选择性结合区域（R76-A89）。CRFR1与CRFR2具有>70%的同源性,其中EC1区同源性最低（60%）。因此根据重要结构域、同源性低、胞外区的原则,选取CRFR1的EC1区域（M 1-V118）作为靶蛋白。2.靶蛋白的表达和纯化:将EC1的cDNA序列连接到原核表达载体pGEX-4T2上,并将其转化到BL21（DE3）感受态细胞中,用IPTG诱导融合蛋白GST-EC1188的表达。SDS-PAGE分析GST- EC1118蛋白主要以包涵体的形式表达。通过优化诱导条件都不能增加可溶性蛋白的表达。分析EC1的氨基酸序列,EC1的M1-N19区域和N108-V118区域富含疏水性氨基酸和含硫氨基酸,疏水键和二硫键过多容易导致包涵体的形成,影响蛋白的溶解性。因此在保证CRFR1的选择性结合区域完整的基础上,去除M1-N19与N108-V118区域,重新选择EC1（P20-N107）片段作为靶蛋白。重新构建原核表达载体pGEX-4T2-CRFR1 EC1（P20-N107）,IPTG低温诱导GST-EC188蛋白的表达。将超声裂解后的上清液用GSTrap FF纯化柱纯化,SDS -PAGE分析鉴定纯化结果,最终获得高纯度的GST-EC188靶蛋白。3.亲和肽的筛选:从Ph.D.-12和Ph.D.-C7C文库中筛选与靶蛋白结合的噬菌体克隆。将靶蛋白GST-EC188与GST固定到固相载体上,Ph.D.-12和Ph.D.-C7C文库先与GST蛋白孵育,将未与GST结合的噬菌体再与靶蛋白结合,洗掉非特异性结合的噬菌体,将特异性结合的噬菌体洗脱下来进行扩增,用于下一轮的筛选,筛选三轮。通过降低靶蛋白的浓度、增加洗脱强度、减少噬菌体与靶蛋白的孵育时间等措施优化筛选条件,筛选到结合力强的噬菌体克隆。用回收率%（回收滴度/投入滴×100）表示噬菌体的富集程度,Ph.D.-12文库第三轮的回收率%（4.2×10-3）是第一轮回收率%（5×10-5）的84倍;Ph.D.-C7C文库第三轮的回收率%（2.5×10-3）是第一轮回收率%（1.5×10-5）的167倍。结果证明经过三轮筛选,与靶蛋白特异性结合的噬菌体克隆得到富集。用ELISA法鉴定噬菌体克隆与靶蛋白的结合力,得到12个阳性克隆。用竞争性ELISA进一步验证亲和力,12个阳性克隆与CRFR1的结合表现为浓度依赖性。分别为Ph.D.-C7C文库1、2、6、7、9、12、14号克隆,Ph.D.-12文库2、5、14、15、16号克隆。分析阳性噬菌体展示肽的氨基酸序列。发现12个噬菌体展示肽均与CRF有一定的同源性,其中Ph.D.-C7C文库P2、P7、P14,Ph.D.-12文库P2、P15、P16与CRF的同源性最高,并且结合力较强。4. HEK293-CRFR1稳定表达细胞株的建立:为鉴定筛选到的小肽的生物活性,构建了HEK293-CRFR1稳定表达细胞株。Western blotting与RT-PCR结果显示CRFR1蛋白表达,以3号克隆表达量高;荧光免疫结果显示CRFR1表达于细胞膜上。CRF刺激HEK293-CRFR1细胞释放cAMP的实验结果说明CRFR1不但稳定表达于HEK293细胞,并且具有功能（EC50 = （8.44±0.68）×10-9 M,n=3）。5.亲和肽功能验证:初步验证12个阳性噬菌体展示肽对CRFR1功能的影响。利用原核表达载体pGEX-4T2,诱导表达与纯化融合表达蛋白GST-小肽,得到高纯度的GST-小肽。用cAMP释放试验验证GST-小肽对CRF刺激HEK293-CRFR1细胞释放cAMP的影响。结果显示,环七肽1、2、6、9、14号小肽,十二肽5、15、16号小肽表现不同程度的抑制作用,其中以十二肽P16抑制作用最强。GST蛋白可能会影响小肽与CRFR1的结合与作用,因此化学合成P16,进一步验证其功能。6. P16拮抗效应及机制研究:6.1验证P16对CRFR1的特异性抑制作用。用CRF刺激HEK293-CRFR1细胞释放cAMP,用P16拮抗此作用。结果显示在CRF（32 nM）存在的条件下,P16抑制CRF刺激HEK293-CRFR1细胞释放cAMP的作用,并且呈现浓度依赖性（IC50 = （1.36±0.60）×10-10 M,n=3）。在没有CRF作用下,不同浓度P16（5 pM10 nM）对HEK293 -CRFR1细胞cAMP的基础水平没有影响。说明P16特异性地抑制CRFR1的功能。6.2验证P16对CRFR2的选择性。CRFR2选择性激动剂UCN3刺激瞬时转染HE-K293-CRFR2细胞释放cAMP量效曲线拟合良好（EC50 = （3.65±0.25）×10-8 M , n= 3）,说明CRFR2表达于HEK293细胞中,并且具有功能。用UCN3（144 nM）刺激瞬时转染HEK293-CRFR2细胞释放cAMP,同时加入P16测定对HEK293-CRFR2细胞释放cAMP的影响。结果显示不同浓度P16（1 pM10μM）对UCN3刺激HEK293 -CRFR2细胞释放cAMP没有影响。说明P16对CRFR2的功能没有影响。6.3验证P16对CRF刺激HEK293-CRFR1细胞释放cAMP量效曲线的影响。结果显示没有P16存在时,CRF量效曲线EC50 = （7.22±0.42）×10-8 M（n=3） ;在0.1 nM P16存在时,CRF量效曲线平行右移,EC50 = （1.10±0.25）×10-7 M （n=3） ;在1 nM P16存在时,CRF标准曲线平行右移幅度大于0.1 nM P16组, EC50=（1.50±0.38）×10-7 M（n=3）。说明P16竞争性地抑制CRF刺激HEK293-CRFR1细胞释放cAMP,P16是CRFR1的竞争性抑制剂。综上所述,本研究建立在可溶性表达了CRFR1重要的结合区域EC1（P20-N107）的基础上,以EC1（P20-N107）为靶蛋白,从Ph.D.-12和Ph.D.-C7C文库中筛选到12个与CRFR1结合强的噬菌体克隆,初步验证小肽对CRFR1的作用,其中P16抑制活性最高。通过观察P16对稳定表达CRFR1的HEK293细胞的作用,发现P16以竞争性抑制的方式,选择性拮抗CRFR1功能,而对CRFR2功能没有明显影响。本研究工作利用噬菌体展示技术筛选到CRFR1特异性竞争性拮抗剂P16等小肽,为靶向CRFR1抗抑郁症小肽类药物的研发奠定了基础。
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相关论文文献
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