抗氧化性生物活性物质对鸡等级前卵泡细胞发育的影响及其机理的研究

论文摘要

家禽卵巢以其卵泡等级发育的特点而成为研究卵巢生物学和卵泡发育的理想模型,而卵泡颗粒细胞因其独特的结构特点及其在卵泡发育中的重要作用,常被看作卵泡发育的一个重要标志。本实验通过小黄卵泡颗粒细胞以及全卵泡体外培养模型,探讨了家禽生产中部分重要的生殖激素、生长因子及与卵泡发育相关的抗氧化性生物活性物质对卵泡粒细胞生长发育和功能的影响及其作用机理,以期为家禽优势卵泡选择及繁殖性能的提高提供理论依据。1.鸡等级前卵泡细胞的形态学变化-卵泡刺激素和前列腺素对等级前卵泡发育的影响本文首先利用形态学方法研究了鸡等级前卵泡中颗粒细胞和膜细胞在发育过程中形态学的变化。从有规则产蛋周期的三黄母鸡中取出等级前卵泡,按照其直径分为小白卵泡（SWF,1～3mm）、大白卵泡（LWF,3～5mm）、小黄卵泡（SYF,5～6 mm）和大黄卵泡（LYF,6-9 mm）。各级卵泡用4%多聚甲醛固定24 h,然后包埋并切片,厚度5μm。切片用苏木精-伊红染色或用增殖细胞核抗原（PCNA）免疫组织化学染色。等级前卵泡组织学研究结果表明：SWF只有一层颗粒细胞,LWF中出现两层颗粒细胞,而SYF和LYF中则有多层颗粒细胞。数据统计显示,卵泡膜层和颗粒细胞层厚度随着卵泡直径的变化而显著增加。SYF和LYF的膜细胞层的厚度是最大的（P<0.05）。颗粒细胞的密度度随着卵泡直径的变化而显著增加（P<0.05）。与LWF、SYF和LYF相比,SWF的颗粒细胞的面积较小（P<0.05）。PCNA免疫组化染色表明：和LYF相比,PCNA标记指数（PCNA-LI）在SWF、LWF和SYF中较高。因此,在卵泡的发育过程中,膜细胞和颗粒细胞在形态和增殖特性上具有阶段特异性。卵泡体外悬浮培养实验表明,卵泡刺激素（FSH）和前列腺素PGE1刺激SYF和LYF中颗粒细胞的增殖,但对膜细胞无显著促增殖作用。由此推测,FSH和PGE1主要通过刺激颗粒细胞的增殖促使等级前卵泡进入等级发育。2.人参皂甙对鸡等级前卵泡发育和小黄卵泡颗粒细胞增殖的影响及其信号转导机制的研究人参属五加科多年生草本植物,其中含有的人参皂甙（GS）因其抗氧化特性而作为保健品,具有调节中枢神经系统、抗疲劳和抗衰老等功效。本文研究了GS对鸡等级前卵泡发育和小黄卵泡颗粒细胞增殖的影响及其信号转导机制。等级前卵泡在0.5%胎牛血清（FCS）中预培养16h后换成无血清的培养液,其中含10 gg／ml胰岛素,5μg／ml转铁蛋白和3×10-8mol／L亚硒酸钠（ITS培养液）,同时单独添加10μg／ml GS处理24 h。结果表明：GS显著刺激SWF、LWF、SYF和LYF的膜层和颗粒层细胞的增殖,提示GS可通过刺激等级前卵泡细胞的增殖而促使其进入等级发育。从SYF中分离的颗粒细胞在含有0.5% FCS的M199培养液中培养,16h后换成无血清培养液并继续进行培养,同时用PKC抑制剂H7、PKC激活剂PMA单独或与GS联合处理24 h。随后进行细胞形态学和GS作用机理的研究。结果显示：当GS浓度在0.1～10μg／ml范围时,颗粒细胞的数量呈显著上升趋势,并呈一定的剂量-效应关系。同时,这一效应可以被H7所抑制,但可被PMA所加强。颗粒细胞的PCNA-LI统计结果显示细胞的增殖活性与颗粒细胞的数目变化呈现类似的变化。Western印迹法表明10μg／ml GS可促进颗粒细胞中PKC从胞质到胞膜的转移,而H7则抑制此效应。同时,GS上调颗粒细胞中细胞周期蛋白D1／周期蛋白依赖性激酶6（CDK6）和周期蛋白E／CDK2mRNA的表达。然而,用PKC抑制剂H7则减弱了这一刺激效应。由此推测,GS通过上调颗粒细胞中细胞周期蛋白D1/CDK6和E/CDK2的表达来刺激颗粒细胞的增殖,从而促使等级前卵泡进入等级发育。3.大豆黄酮对鸡等级前卵泡发育和小黄卵泡颗粒细胞增殖的影响本实验利用全卵泡培养和颗粒细胞单独培养模型探讨了植物性抗氧化剂大豆黄酮（DAI）对产蛋鸡等级前小黄卵泡及颗粒细胞增殖的影响。等级前卵泡在0.5%FCS中预培养16 h后换成无血清的ITS培养液,同时单独添加10-1000 ng／ml的DAI处理24 h。结果表明：DAI显著刺激SWF、LWF、SYF和LYF的膜层和颗粒层细胞的增殖,提示DAI通过刺激等级前卵泡细胞的增殖而促使其进入等级发育。采用机械法分散产蛋鸡等级前小黄卵泡颗粒细胞。培养液为含0.5%FCS的M199培养液。颗粒细胞预培养16h后,撤去血清,换用ITS培养液。细胞用DAI处理24 h后对其增殖活性进行检测。结果显示：10～1000 ng／ml的DAI处理可显著增加颗粒细胞的数目（P<0.05）,这一刺激作用可被雌激素受体阻断剂他莫昔芬所阻断,并呈现出一定的剂量-效应关系。同时,颗粒细胞的BrdU-LI结果显示出细胞的增殖活性与其数目的变化呈现出相似的变化。由此推测,DAI可通过雌激素活性刺激颗粒细胞的增殖而促使等级前卵泡进入等级发育。总之,本实验通过在体的形态学和免疫组化方法研究了产蛋鸡等级前卵泡发育过程中颗粒细胞和膜细胞数量的变化,膜细胞和颗粒细胞在形态和增殖特性上呈现出阶段特异性。颗粒细胞的增殖活性随等级前卵泡的发育而降低。全卵泡体外悬浮培养实验表明,FSH和PGE1主要通过刺激颗粒细胞的增殖而促使等级前卵泡进入等级发育；植物性抗氧化剂GS和DAI可显著刺激SWF、LWF、SYF和LYF中颗粒细胞的增殖,促使等级前卵泡进入等级发育。利用等级前卵泡颗粒细胞单独培养模型证明：GS可上调颗粒细胞中细胞周期蛋白D1/CDK6和E/CDK2 mRNA的表达来促进其增殖,PKC信号途径可能参与GS对颗粒细胞增殖的调控；DAI可通过雌激素样作用显著促进颗粒细胞的增殖。这些结果在理论上有助于阐明家禽等级前卵泡发育和优势卵泡选择的调控机理,在生产实际上也可为植物来源的抗氧化性生物活性物质的开发应用及家禽繁殖性能的提高提供了理论基础。

论文目录

摘要

ABSTRACT

缩略词表

第一章文献综述

第一节禽类卵泡发育的特点及阶段划分

1.1 禽类卵泡发育的特点

1.2 禽类卵泡发育的阶段划分

第二节颗粒细胞在卵泡发育中的作用

2.1 颗粒细胞在卵母细胞发育中的作用

2.1.1 营养作用

2.1.2 调节作用

2.2 颗粒细胞对卵泡发育的调控

2.2.1 颗粒细胞与原始卵泡的生长启动

2.2.2 颗粒细胞对生长期卵泡发育的调控

2.2.3 颗粒细胞对卵泡闭锁的影响

2.3 细胞间互作对卵泡发育的影响

2.3.1 细胞外基质对禽类卵泡发育的影响

2.3.2 缝隙连接对禽类卵泡发育的影响

2.3.3 缝隙连接对颗粒细胞分层的作用

2.3.4 缝隙连接对黄体形成的影响

2.3.5 缝隙连接在促性腺激素信号传递中的作用

第三节激素对禽类卵泡发育的调控

3.1 促性腺激素

3.2 类固醇激素

3.3 前列腺素

3.3.1 前列腺素在体内的生物合成

3.3.2 前列腺素的化学结构和分类

3.3.3 前列腺素的生理作用

3.4 促性腺激素释放激素

3.5 催乳素

第四节人参皂甙和大豆黄酮对卵泡发育的作用

4.1 人参皂甙在家禽繁殖中的应用

4.1.1 人参皂甙的结构分类

4.1.2 人参皂甙的生物学功能

4.2 大豆黄酮在家禽繁殖中的应用

4.2.1 异黄酮植物雌激素的种类、结构及其理化特性

4.2.2 异黄酮的吸收与代谢

4.2.3 异黄酮在畜禽生产中的应用

4.2.4 异黄酮的作用机理

第五节本研究的目的和内容

5.1 本研究的目的和意义

5.2 研究目标及内容

第二章鸡等级前卵泡细胞的形态学变化-卵泡刺激素和前列腺素对鸡等级前卵泡细胞发育的影响

第一节鸡等级前卵泡发育的形态学变化

1 引言

2 材料和方法

2.1 实验动物

2.2 主要器材

2.3 主要试剂

2.4 药物配制

2.5 形态学研究

2.6 免疫组织化学染色

2.7 细胞形态观察

2.8 数据分析

3 结果

3.1 等级前卵泡膜层和颗粒层的形态学变化

3.2 等级前卵泡颗粒细胞数量和面积的变化

3.3 等级前卵泡颗粒细胞PCNA标记指数的变化

4 讨论

第二节卵泡刺激素对鸡等级前卵泡细胞发育的影响

1 引言

2 材料与方法

2.1 实验动物

2.2 主要器材

2.3 主要试剂及配制

2.4 卵泡的培养和激素处理

2.5 形态学研究

2.6 细胞形态观察

2.7 数据分析

3 结果

3.1 FSH对膜层和颗粒层细胞增殖的影响

3.2 FSH对培养的卵泡中颗粒细胞增殖的影响

4. 讨论

第三节前列腺素对鸡等级前卵泡细胞发育的影响

1 引言

2 材料与方法

2.1 实验动物

2.2 主要器材

2.3 主要试剂及配制

2.4 卵泡的培养和激素处理

2.5 形态学研究

2.6 细胞形态观察

2.7 数据分析

3 结果

1对膜颗粒细胞层增殖的影响'>3.1 PGE₁对膜颗粒细胞层增殖的影响

1对膜细胞层增殖的影响'>3.2 PGE₁对膜细胞层增殖的影响

1对颗粒细胞增殖的影响'>3.3 PGE₁对颗粒细胞增殖的影响

4 讨论

第三章人参皂甙对小黄卵泡颗粒细胞增殖的影响

第一节人参皂甙对鸡等级前卵泡细胞增殖的影响

1 引言

2 材料与方法

2.1 实验动物

2.2 主要器材

2.3 主要试剂及配制

2.4 卵泡的培养和激素处理

2.5 形态学研究

2.6 细胞形态观察

2.7 数据分析

3 结果

3.1 GS对颗粒层厚度的影响

3.2 GS对膜层厚度的影响

3.3 GS对颗粒细胞数量的影响

4 讨论

第二节人参皂甙对小黄卵泡颗粒细胞增殖的影响

1 引言

2 材料与方法

2.1 实验动物

2.2 主要器材

2.3 主要试剂及配制

2.4 颗粒细胞的分离

2.5 颗粒细胞的培养

2.6 PCNA免疫细胞化学染色步骤

2.7 细胞形态的观察

2.8 数据分析

3 结果

3.1 GS对颗粒细胞增殖的影响

7对GS促颗粒细胞增殖作用的影响'>3.2 H₇对GS促颗粒细胞增殖作用的影响

3.3 PMA对GS促颗粒细胞增殖的影响作用

3.4 GS对PKC蛋白膜转位的影响

3.5 GS对细胞周期蛋白mRNA表达的影响

4 讨论

第四章大豆黄酮对鸡等级前卵泡细胞增殖的影响

第一节大豆黄酮对鸡等级前卵泡细胞增殖的影响

1 引言

2 材料与方法

2.1 实验动物

2.2 主要器材

2.3 主要试剂及配制

2.4 卵泡的培养和激素处理

2.5 形态学研究

2.6 细胞形态观察

2.7 数据分析

3 结果

3.1 DAI对颗粒细胞层增殖的影响

3.2 DAI对膜细胞层增殖的影响

3.3 DAI对颗粒细胞增殖的影响

4 讨论

第二节大豆黄酮对鸡小黄卵泡颗粒细胞增殖的影响

1 引言

2 材料与方法

2.1 实验动物

2.2 主要器材

2.3 主要试剂及配制

2.4 颗粒细胞的培养

2.5 BrdU免疫细胞化学染色步骤

2.6 细胞形态观察

2.7 数据分析

3 结果

3.1 DAI对颗粒细胞增殖的影响

3.2 TAM对DAI促颗粒细胞增殖的影响

4 讨论

第五章提示和创新点

参考文献

致谢

博士期间发表文章

抗氧化性生物活性物质对鸡等级前卵泡细胞发育的影响及其机理的研究

论文摘要

论文目录

相关论文文献

猜你喜欢