猪瘟病毒E0-E2基因重组鸡痘病毒遗传稳定性和免疫剂量研究

论文摘要

猪瘟（Classical swine fever,CSF）是由猪瘟病毒（CSFV）引起的猪和野猪的一种高度致死性、接触性传染病,是严重威胁全球养猪业的疫病之一。猪瘟疫苗的免疫接种是预防猪瘟的一种有效手段。本文对猪瘟候选疫苗CSFV E0-E2基因重组鸡痘病毒活载体疫苗的毒种遗传稳定性和疫苗免疫剂量进行了研究,获得了以下结果。1.将重组鸡痘病毒rFPV-E0-E2在鸡胚成纤维细胞上连续传了20代,取第5、10、15和20代重组病毒,分别用蓝斑试验、PCR扩增和基因序列分析以及间接免疫荧光试验研究了重组病毒的遗传稳定性。结果各代次的重组病毒产生的蚀斑均为蓝色,从各代重组病毒DNA中均扩增出了E0和E2基因,基因序列分析发现仅第20代重组病毒插入基因发生2个点突变,即E0基因139A→G,E2基因413A→G。间接免疫荧光也能够检测到目的蛋白的表达。结果表明重组鸡痘病毒rFPV-E0-E2在鸡胚成纤维细胞上传20代以内具有良好的遗传稳定性,插入的CSFV E0-E2基因能够正确稳定表达。2.用CEF细胞扩增了3批重组鸡痘病毒rFPV-E0-E2,并对其进行了纯度、病毒含量、特异蛋白的表达的检测和无菌检验。结果表明,3批重组病毒rFPV-E0-E2具有较高纯度,无细菌和霉菌污染,其TCID50分别为10-7.5/0.025 mL、10-9/0.025 mL和10-9/0.025 mL,并且均能够正常表达CSFV E0-E2基因,拟作为疫苗的原始毒种种子批使用。同时,实验室生产并检验了1批猪瘟病毒E0-E2基因重组鸡痘病毒活载体疫苗毒,测得CSFVShimen株对50～60日龄的猪瘟易感猪的LD50为10-2.8/2mL,为进行猪瘟病毒E0-E2基因重组鸡痘病毒免疫剂量试验提供了材料和依据。3.使用变量免疫定量攻毒方法进行了CSFV基因重组鸡痘病毒的免疫剂量试验。将23头猪随机分成6组,分别以不同程序免疫不同剂量的重组鸡痘病毒。免疫后28d,每头猪经颈部肌肉注射100 LD50的Shimen株CSFV,继续观察21 d,评价疫苗免疫保护效果。结果以1.04×107pfu的CSFV基因重组鸡痘病毒rFPV-E0-E2接种两次的猪受到100LD50的CSFVShimen株肌肉注射攻击时,能够获得50%的临床保护,即该疫苗对CSFV攻毒临床症状的PD50为2×1.04×107pfu。该结果为确定疫苗免疫剂量提供了依据。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 文献综述
• 第一章 猪瘟及猪瘟疫苗研究进展
• 1.1 猪瘟的病原
• 1.2 猪瘟的感染与临床症状
• 1.3 猪瘟的诊断
• 1.3.1 临床诊断
• 1.3.2 实验室诊断
• 1.4 猪瘟的防控
• 1.5 猪瘟疫苗研究进展
• 1.5.1 猪瘟传统疫苗
• 1.5.2 猪瘟新型疫苗
• 1.5.3 展望
• 第二章 鸡痘病毒载体研究进展
• 2.1 FPV的主要特性
• 2.2 FPV的培养
• 2.3 FPV作为载体的特性
• 2.4 FPV病毒载体的应用
• 2.4.1 FPV载体在禽类中的的应用
• 2.4.2 FPV载体在哺乳动物中的应用
• 2.5 rFPV的遗传稳定性
• 试验研究
• 第三章 猪瘟病毒E0-E2基因重组鸡痘病毒的遗传稳定性
• 3.1 材料
• 3.1.1 毒种
• 3.1.2 主要仪器
• 3.1.3 主要药品及试剂
• 3.2 方法
• 3.2.1 重组病毒rFPV-E0-E2的传代
• 3.2.2 重组病毒rFPV-E0-E2的蓝斑纯度鉴定
• 3.2.3 引物的设计与合成
• 3.2.4 重组病毒DNA制备
• 3.2.5 E0、E2基因的PCR扩增
• 3.2.6 E0、E2基因的克隆与测序分析
• 3.2.7 基因表达产物的间接免疫荧光检测
• 3.3 结果
• 3.3.1 重组病毒rFPV-E0-E2的蓝斑纯度检验
• 3.3.2 重组病毒中E0和E2基因的PCR扩增
• 3.3.3 E0、E2基因的克隆与测序分析
• 3.3.4 基因表达产物的间接免疫荧光检测
• 3.4 讨论
• 3.5 小结
• 50测定'>第四章 猪瘟病毒E0-E2基因重组鸡痘病毒种子批建立、疫苗毒制备及CSFV Shimen株LD₅₀测定
• 4.1 材料
• 4.1.1 毒种
• 4.1.2 引物合成
• 4.1.3 主要仪器
• 4.1.4 主要药品及试剂
• 4.1.5 实验动物
• 4.2 方法
• 4.2.1 重组病毒rFPV-E0-E2毒种的增殖
• 4.2.2 病毒含量测定
• 4.2.3 蓝斑鉴定
• 4.2.4 rFPV的PCR鉴定
• 4.2.5 CSFV E0-E2表达蛋白的免疫荧光检测
• 4.2.6 无菌检验
• 4.2.7 疫苗毒制备
• 4.2.8 疫苗毒检验
• 4.2.9 CSFV Shimen株半数致死量测定
• 4.3 结果
• 4.3.1 重组病毒rFPV-E0-E2毒种的增殖与鉴定
• 4.3.2 疫苗毒制备与检验
• 50测定'>4.3.3 CSFV Shimen株LD₅₀测定
• 4.4 讨论
• 4.5 小结
• 第五章 猪瘟病毒E0-E2基因重组鸡痘病毒免疫剂量试验
• 5.1 材料
• 5.1.1 病毒
• 5.1.2 工具酶及试剂
• 5.1.3 试验用动物
• 5.2 方法
• 5.2.1 疫苗免疫与攻毒
• 5.2.2 血清ELISA抗体的检测
• 5.2.3 临床观察
• 5.2.4 血液中CSFV的检测
• 5.2.5 病理观察
• 5.2.6 疫苗抑制排毒的检测
• 5.2.7 半数保护剂量的确定
• 5.3 结果
• 5.3.1 疫苗安全性
• 5.3.2 抗体检测
• 5.3.3 临床症状
• 5.3.4 病理变化
• 5.3.5 攻毒后血液中CSFV的检测
• 5.3.6 疫苗阻止排毒
• 5.3.7 半数保护剂量的确定
• 5.4 讨论
• 5.5 小结
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 作者简介