酿酒酵母中木酮糖激酶基因的克隆与表达

论文摘要

酿酒酵母可以利用木酮糖发酵,但由于木酮糖代谢途径不畅和氧化还原不平衡等原因,含有毕赤树干酵母木糖还原酶和木糖醇脱氢酶编译基因的重组酿酒酵母在木糖培养基上出现木糖醇积累,从而导致木糖生产乙醇的产率较低。本研究将毕赤树干酵母的木糖还原酶基因、木糖醇脱氢酶基因和木酮糖激酶基因同时引入酿酒酵母并表达,从而达到疏通酿酒酵母木糖代谢途径,提高木糖利用率和乙醇产率的目的。采用Oligo和Primer PREMIER软件设计得到毕赤树干酵母木酮糖激酶基因xy13（gig100399,2942bp）的PCR上游引物5’-CCAACCAGCAGCGTGTG-3’和下游引物5’-TCTATCGTGATATTCGCACAT-3’,经过PCR反应由毕赤树干酵母基因组成功扩增出长度为2704bp木酮糖激酶基因X3片段,X3序列与xy13基因相似性达到98%,含有酿酒酵母基因转录所必需的区域。由起始密码子ATG开始转译合成的多肽链含有623个氨基酸残基,相对分子量为69324Da。X3序列与酿酒酵母木酮糖激酶基因xksl的相似性达到35.46%。蛋白序列相似性达到34.2%,蛋白序列存在高度保守区域。以酵母附加型质粒YEp24成功构建得到了重组质粒YEp24-X3,又以重组质粒YEp24-X3和含有木糖还原酶基因（X1）、木糖醇脱氢酶基因（X2）的质粒YEp24-X1X2构建了同时含有X1、X2和X3基因的重组质粒YEp24-X1X2X3。采用乙酸锂转化法转化营养缺陷型酿酒酵母菌株Saccharomyces cerevisiae 1949得到了重组酿酒酵母菌株S.c R5。重组酵母S.cR5能够利用木糖,利用分子生物学手段检测重组菌含有酵母表达质粒YEp24-X1X2X3,即成功得到了同时含有毕赤树干酵母木糖还原酶基因、木糖醇脱氢酶基因和木酮糖激酶基因的重组酿酒酵母菌株,为木糖代谢研究提供了种质资源。重组酵母菌株S.c R5在YCM培养基上利用木糖的能力较宿主菌有了较大幅度的提高。同时供氧水平可显著影响重组酵母菌株S.c R5的木糖代谢,在不同的供养条件下酵母代谢木糖的能力有明显差异。在好氧条件下重组酵母菌株S.c R5可以代谢发酵液中99.5%的木糖,乙醇浓度达到0.46g/l,在厌氧条件下S.c R5能够发酵木糖生成乙醇,得率达到理论得率的19%。这表明,转入的毕赤树干酵母木糖还原酶基因、木糖醇脱氢酶基因和木酮糖激酶基因可以对酿酒酵母木糖发酵乙醇起到促进作用。本研究已成功获得了能够发酵木糖生成乙醇的重组酿酒酵母菌株,达到了预期目的。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• ABSTRACT
• 1 前言
• 1.1 研究背景
• 1.2 研究的目的和内容
• 2 文献综述
• 2.1 生物乙醇的发展
• 2.2 植物纤维原料生产乙醇
• 2.3 木糖的乙醇发酵
• 2.4 可发酵木糖生成乙醇的微生物
• 2.5 微生物的木糖代谢途径
• 2.5.1 木糖转化成木酮糖
• 2.5.2 木酮糖生成5-磷酸木酮糖
• 2.5.3 磷酸戊糖途径
• 2.5.4 乙醇生成
• 2.6 氧对木糖代谢的影响
• 2.7 木糖发酵重组酿酒酵母研究现状
• 3 木酮糖激酶基因的结构分析与合成
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 菌种
• 3.2.2 DNA序列获取
• 3.2.3 基因组DNA获取
• 3.2.4 DNA引物设计
• 3.2.5 DNA序列PCR扩增
• 3.2.6 电泳分析
• 3.2.7 DNA测序
• 3.2.8 DNA序列的相似性分析
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 PCR引物的设计与PCR扩增
• 3.3.2 木酮糖激酶基因X3的测序与结构分析
• 3.3.3 酵母基因相似性比对
• 3.4 小结
• 4 木糖代谢重组酿酒酵母的构建
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 菌种和质粒
• 4.2.2 PCR扩增X1、X2、X3、URA3以及ITS序列
• 4.2.3 DNA电泳分离与凝胶纯化
• 4.2.4 限制性酶切和酶连反应
• 4.2.5 质粒转化与提取
• 4.2.6 重组酵母菌株的生理学特性鉴定
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 质粒T-X3的构建
• 4.3.2 构建含有X3序列的表达质粒
• 4.3.3 PCR扩增YEp-X1X2
• 4.3.4 构建表达质粒YEP24-X1X2X3
• 4.3.5 重组酵母菌株的构建及生理学、形态学鉴定
• 4.3.6 重组酵母菌株的分子学鉴定
• 4.4 小结
• 5 重组酵母菌株木糖发酵性能的研究
• 5.1 引言
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 酵母菌株
• 5.2.2 重组酵母菌株液体发酵
• 5.2.3 好氧发酵
• 5.2.4 兼气发酵
• 5.2.5 厌氧发酵
• 5.2.6 酵母兼气分批发酵
• 5.2.7 发酵液分析
• 5.2.8 发酵液的高效液相色谱（HPLC）分析
• 5.3 结果与讨论
• 5.3.1 重组酵母菌株的好氧发酵性能
• 5.3.2 重组酵母菌株的兼气发酵性能
• 5.3.3 重组酵母菌株的厌氧发酵性能
• 5.3.4 重组酵母兼气条件下分批发酵
• 5.3.5 酵母菌木糖发酵碳元素物料衡算
• 5.4 重组酵母菌株的木糖代谢性能评价与分析
• 5.5 小结
• 6 结论
• 参考文献
• 附页:X3序列侧序图谱
• 详细摘要