人乳头瘤病毒58型L1基因在毕赤酵母中的表达及鉴定

论文摘要

人乳头瘤病毒（Human Papil1omavirus, HPV）是一种引起人类皮肤、粘膜的乳头状瘤或疣,并可导致恶性病变的病原体。研究表明,90%宫颈癌的发生与人乳头瘤病毒感染有关。世界各地高危型HPV的各型感染率区别较大,除HPV16是公认发病率最高之外,HPV18及HPV58也较常见,特别是HPV58在亚洲地区表现出不同寻常的流行状况。亚洲地区HPV58的感染率明显高于世界其它地区。而在我国HPV58型也是仅次于HPV16型的高危型别。目前,世界范围内对HPV58型的进一步研究较少。基于HPV58在我国子宫颈癌中的特殊位置,我们开展了HPV58型的研究工作。本次实验我们首先以从病理组织中提取的HPV58的基因组为模板,利用PCR的方法获得主要衣壳蛋白L1,并构建到分泌型酵母表达载体pPICZαB形成整合质粒,电转GS115酵母细胞,筛选阳性重组子,选取表达量较高的菌株进行5L发酵罐的表达,表达产物经纯化后,以本实验所制备的抗体,进行Western-Blot鉴定。结果显示,在发酵液上清中有特异蛋白条带,分子量56kD左右,证明我们得到了目的蛋白。

论文目录

• 内容提要
• 第一章前言
• 1.1 人乳头瘤病毒（HPV）简介
• 1.1.1 HPV 的分型
• 1.1.2 人乳头瘤病毒（HPV）的分子生物学特征
• 1.1.3 HPV 的致癌机制
• 1.1.4 HPV 预防性疫苗的研究进展
• 1.1.5 HPV58 与宫颈癌
• 1.1.6 真核表达系统的选择
• 1.2 本论文设计的构思
• 1.2.1 实验目的
• 1.2.2 实验思路
• 第二章 实验材料和方法
• 2.1 材料、仪器和试剂
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 主要仪器
• 2.1.3 常用试剂配置
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 PCR
• 2.2.2 连接反应
• 2.2.3 大肠杆菌E.coli 感受态的制备
• 2.2.4 连接产物转化E.coli 感受态细胞
• 2.2.5 质粒的小量提取（碱裂变法）
• 2.2.6 限制性内切酶作用
• 2.2.7 质粒的大规模提取
• 2.2.8 IPTG 诱导大肠杆菌预表达
• 2.2.9 IPTG 诱导大肠杆菌大量表达
• 2.2.10 样品纯化前处理
• 2.2.11 包涵体的镍柱亲和层析
• 2.2.12 毕赤酵母电转化感受态细胞的制备
• 2.2.13 连接产物电转化酵母感受态细胞
• 2.2.14 酵母基因组的的提取
• 2.2.15 酵母重组子摇瓶筛选
• 2.2.16 蛋白质分子量检测（SDS-PAGE）
• 2.2.17 5L 发酵罐发酵毕赤酵母
• 2.2.18 蛋白的纯化
• 2.2.19 Western-Blot
• 第三章 结果与讨论
• 3.1 HPV58L1 基因在真核表达系统中的构建与鉴定
• 3.1.1 PCR 体外扩增HPV58L1 基因
• 3.1.2 HPV58 L1 与毕赤酵母表达载体的连接与鉴定
• 3.2 HPV58L1 多克隆抗体的制备
• 3.2.1 HPV58 L1 在原核表达系统中的构建与鉴定
• 3.2.2 HPV58L1 蛋白的表达和纯化
• 3.2.3 HPV58 L1 抗体的获得
• 3.3 酵母重组子的获得与筛选
• 3.3.1 HPV58 L1 电转化毕赤酵母
• 3.3.3 摇瓶筛选重组子
• 3.4 酵母重组子的表达、纯化与鉴定
• 3.4.1 酵母重组子的5L 发酵罐表达
• 3.4.2 酵母重组子表达产物的纯化
• 3.4.3 酵母重组子表达产物的鉴定
• 参考文献
• 摘要
• ABSTRACT
• 致谢
• 导师简介
• 作者简介