论文摘要
目的:胃癌、大肠癌是我国常见的恶性肿瘤。二者在临床发现时多为晚期阶段,手术后常有转移,因此,化疗成为必要的治疗手段。然而,肿瘤细胞产生对化疗药物的耐药性影响了化疗的治疗效果。尽管近年对肿瘤耐药性逆转的研究很多,但由于肿瘤耐药性发生的机制不清楚,故到目前为止尚无令人振奋的成果出现。目前认为肿瘤耐药性产生的直接机制是肿瘤细胞中一些与抵抗药物有关的蛋白表达增强。这些蛋白或能将化疗药物排出细胞,使细胞内有效药物浓度下降以致不能发挥杀伤作用,或能降低药物毒性。现已发现了十余种这类蛋白,包括:P糖蛋白（P-gp）、多药耐药相关蛋白（MRP）、肺耐药相关蛋白（LRP）、谷胱苷肽-S-转移酶-π（GST-π）等,它们在不同肿瘤及肿瘤对不同化疗药物的耐药产生过程中发挥作用。然而,较少有人研究肿瘤细胞产生及上调这些蛋白表达的机制。同正常细胞特别是不稳定细胞一样,肿瘤细胞也需要基因修复系统,以修复各种原因引起的基因损伤。错配修复（Mismatch Repair,MMR）系统就是其中之一,它可以纠正DNA复制过程中发生的碱基错配,维持基因组稳定。该系统功能丧失时,DNA复制过程中发生的错配得不到修复,基因组突变聚积,易变性增加,致使基因表达紊乱。这是胃癌、大肠癌、子宫内膜癌等一些不稳定细胞来源恶性肿瘤发生的重要原因。研究发现肿瘤耐药性产生过程中也常伴有MMR系统功能异常。那么肿瘤耐药性产生是否与MMR系统功能缺失引起的基因不稳定性所导致的耐药相关基因表达紊乱有关呢?本研究通过检测胃癌细胞株BGC-823、大肠癌细胞株LoVo在顺铂（cDDP）、5-氟尿嘧啶（5-FU）诱导耐药性产生过程中耐药蛋白P-gp、MRP、LRP、GST-π和错配修复蛋白hMSH2、hMLH1的表达变化,分析二者表达的关系,探讨胃肠道癌耐药性产生的机制。方法:1.胃癌耐药细胞株BGC-823/cDDP、BGC-823/5-FU及大肠癌耐药细胞株LoVo/5-FU的建立和它们耐药指数的测定:①采用小剂量、逐步递增cDDP浓度,间歇作用体外诱导法,建立胃癌耐药细胞株BGC-823/cDDP;采用大剂量冲击,逐步递增5-FU浓度,间歇作用体外诱导法,建立胃癌耐药细胞株BGC-823/5-FU;采用5-FU大剂量间断冲击法,建立大肠癌耐药细胞株LoVo/5-FU。②用MTT法检测耐药细胞株BGC-823/cDDP、BGC-823/5-FU、LoVo/5-FU的耐药指数。2.耐药蛋白表达的检测:用免疫细胞化学法和Western·blot法检测胃癌细胞株BGC-823及其耐药细胞株BGC-823/cDDP、BGC-823/5-FU和大肠癌细胞株LoVo及其耐药细胞株LoVo/5-FU的耐药蛋白P-gp、MRP、LRP、GST-π表达情况,比较亲本株与耐药株这些蛋白表达的差异。3.错配修复蛋白表达的检测:用免疫细胞化学法检测胃癌细胞株BGC-823及其耐药细胞株BGC-823/cDDP、BGC-823/5-FU和大肠癌细胞株LoVo及其耐药细胞株LoVo/5-FU的错配修复蛋白hMSH2、hMLH1表达情况,比较亲本株与耐药株这两个蛋白表达的差异。结果:1.耐药细胞株及其耐药指数:①历时约8个月耐药培养,获得胃癌耐药细胞株BGC-823/cDDP,其对cDDP的耐药指数为3.93。②历时约4个月耐药培养,获得胃癌耐药细胞株BGC-823/5-FU,其对5-FU的耐药指数为8.21。③历时约4个月耐药培养,获得大肠癌耐药细胞株LoVo/5-FU,其对5-FU的耐药指数为10.26。2.耐药蛋白表达:①胃癌细胞株BGC-823与其耐药株BGC-823/ cDDP:免疫细胞化学法检测示耐药蛋白LRP、GST-π在亲本株与耐药株均有表达,但在耐药株的表达明显强于亲本株。②胃癌细胞株BGC-823与其耐药株BGC-823/5-FU:免疫细胞化学法检测示耐药蛋白P-gp、MRP、LRP、GST-π在亲本株与耐药株均有表达,但在耐药株的表达明显强于亲本株;Western·blot法检测示耐药蛋白P-gp、MRP、LRP、GST-π在亲本株与耐药株均有表达,但耐药株明显强于亲本株。③大肠癌细胞株LoVo与其耐药株LoVo/5-FU:免疫细胞化学法检测示耐药蛋白P-gp、MRP、LRP、GST-π在亲本株与耐药株均有表达,但在耐药株的表达明显强于亲本株;Western·blot法检测示耐药蛋白P-gp、MRP、LRP、GST-π在亲本株与耐药株均有表达,但耐药株明显强于亲本株。3.错配修复蛋白表达:①胃癌细胞株BGC-823与其耐药株BGC-823/cDDP:免疫细胞化学法检测示错配修复蛋白hMSH2、hMLH1在亲本株与耐药株均有表达,但hMSH2表达在耐药株明显弱于亲本株,而hMLH1表达在亲本株和耐药株间未见明显差异。②胃癌细胞株BGC-823与其耐药株BGC-823/5-FU:免疫细胞化学法检测示错配修复蛋白hMSH2、hMLH1在亲本株与耐药株均有表达,但hMSH2表达在耐药株明显弱于亲本株,而hMLH1表达在亲本株和耐药株间未见明显差异。③大肠癌细胞株LoVo及其耐药株LoVo/5-FU:免疫细胞化学法检测示错配修复蛋白hMSH2、hMLH1在亲本株与耐药株均有表达,但hMSH2表达在耐药株明显弱于亲本株,而hMLH1表达在亲本株和耐药株间未见明显差异。细胞株BGC-823、LoVo耐药产生后,错配修复蛋白表达呈相同模式。结论:1.化疗药物作用前,胃癌、大肠癌细胞株BGC-823、LoVo已有P-gP、MRP、LRP、GST-π的表达,表明P-gP、MRP、LRP、GST-π与消化道肿瘤原发耐药性有关。2.胃癌细胞对cDDP产生耐药的机制可能是LRP、GST-π蛋白的表达。3.胃癌、大肠癌细胞对5-FU耐药的机制可能是P-gp、MRP、LRP、GST-π蛋白的表达。4.耐药细胞株BGC-823/cDDP、BGC-823/5-FU、LoVo/5-FU均有hMSH2表达下调,提示hMSH2蛋白缺失是肿瘤耐药性产生的原因。5.化疗药物对MMR系统功能抑制所导致的细胞基因不稳定可能是肿瘤细胞MDR产生的原因之一。