低盐榨菜自然发酵微生物群落动态的变化与功能分析

论文摘要

采用PCR-SSCP方法,分析低盐榨菜腌制过程中微生物群落结构,对SSCP图谱中11条优势条带进行了切胶回收、克隆测序,序列比对结果表明,榨菜发酵初期,肠膜明串珠菌为主要的优势菌群;随着腌制环境条件的变化,出现了植物乳杆菌和短乳杆菌;在腌制保存后期起主导作用的微生物为植物乳杆菌和Lactobacillus versmoldensis。总DNA提取采用改进的SDS高盐提取法,微生物多样性较高;采用洗脱液（0.5 M醋酸铵;10 mM醋酸镁;1 mM乙二胺四乙酸,pH 8.0; 0.1%十二烷基硫酸钠）结合琼脂糖凝胶回收试剂盒回收PAGE胶目的DNA片段,简便且回收效率高。为了研究优势乳酸菌在榨菜腌制过程中的功能,采用传统的分离培养方法从低盐腌制榨菜中分离到三株乳酸菌L32、L33、L34,经过简单的生理生化试验,发现三株菌均为革兰氏染色阳性、无芽孢、接触酶阴性菌株;乳酸纸层析试验结果表明,三株菌均能产生乳酸,属于乳酸菌;葡萄糖产酸产气试验结果表明,L32、L34为同型发酵乳酸菌,L33为异型发酵乳酸菌;三株菌16S rRNA序列比对结果表明,L32为弯曲乳杆菌,L33为嗜柠檬酸明串珠菌,L34为植物乳杆菌,与SSCP方法得到的优势乳酸菌基本一致。三株菌的最适生长温度均为30℃,最适生长pH均为6.5,培养6 h即进入稳定期,在0-8%的盐度下均能生长。研究了榨菜低盐腌制工艺的品质特性变化,榨菜腌制过程中pH值始终呈下降趋势,由初始pH 6.0开始下降,最后稳定在pH 3.7左右;乳酸菌数量经历了一个先急速上升,在第10天达到峰值3×108cfu/mL后逐渐减少,最后稳定在1×108 cfu/mL左右的过程;亚硝酸盐含量也呈现出先急速上升,在第3天达到峰值8.39 mg/kg后快速下降,之后趋于平缓,最后稳定在1 mg/kg左右。L32、L33、L34三株乳酸菌发酵上清液对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌都表现出良好的抑菌效果。将MRS液体培养基pH调至各乳酸菌发酵液终点pH,抑菌圈直径较原发酵液只下降30%左右,说明在发酵液中最主要的抑菌物质是乳酸;将各乳酸菌发酵上清液经过氧化氢酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶处理后,抑菌圈直径都有不同程度的下降,说明除乳酸外,发酵液中还含有过氧化氢、细菌素等抑菌物质。综上所述,乳酸菌是榨菜自然发酵过程中主要的优势菌群,对于榨菜发酵及其品质特性变化起着较重要的作用,主要表现在:乳酸菌发酵产酸,降低制品pH值;减少制品中亚硝酸盐含量;对有害微生物及某些杂菌的抑制作用。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 引言
• 1 绪论
• 1.1 腌制蔬菜发展现状
• 1.1.1 腌制蔬菜简介
• 1.1.2 问题与现状
• 1.1.3 发展趋势
• 1.2 榨菜研究进展
• 1.2.1 榨菜简介
• 1.2.2 研究概况
• 1.3 传统方法研究榨菜中的微生物
• 1.3.1 研究概况
• 1.3.2 榨菜中的乳酸菌
• 1.3.3 问题与现状
• 1.4 分子生物学方法研究榨菜中的微生物
• 1.4.1 SSCP 方法简介
• 1.4.2 研究概况
• 1.4.3 其他分子生物学技术
• 1.5 腌制榨菜中乳酸菌的功能
• 1.5.1 乳酸菌简介
• 1.5.2 乳酸菌发酵榨菜机理
• 1.5.3 乳酸菌的抑菌特性
• 1.5.4 腌制蔬菜中的亚硝酸盐
• 1.6 立题的背景与研究目的
• 1.6.1 立题背景
• 1.6.2 研究目的
• 2 SSCP 法分析榨菜腌制过程中微生物群落结构
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 原料
• 2.1.2 主要材料及试剂
• 2.1.3 主要仪器设备
• 2.1.4 SSCP 分析
• 2.1.5 回收条带的克隆
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 基因组DNA 提取结果
• 2.2.2 PCR 扩增结果
• 2.2.3 SSCP 结果
• 2.2.4 测序结果
• 2.2.5 群落中部分微生物的功能分析
• 2.3 讨论
• 2.3.1 DNA 提取方法
• 2.3.2 PCR 反应条件
• 2.3.3 酶切方法
• 2.3.4 银染方法
• 2.3.5 PAGE 胶回收方法
• 2.4 本章小节
• 3 乳酸菌的分离鉴定及其生物学基本特性分析
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 原料
• 3.1.2 主要材料及试剂
• 3.1.3 主要仪器设备
• 3.1.4 低盐榨菜的腌制
• 3.1.5 乳酸菌的分离、纯化及保存
• 3.1.6 乳酸菌初步鉴定
• 3.1.7 乳酸菌的分子鉴定
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 乳酸菌的初步鉴定
• 3.2.2 乳酸菌的分子鉴定
• 3.2.3 乳酸菌的生长特性
• 3.3 讨论
• 3.4 本章小节
• 4 乳酸菌在榨菜腌制中的作用
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 原料
• 4.1.2 主要材料及试剂
• 4.1.3 主要仪器设备
• 4.1.4 乳酸菌数量的测定
• 4.1.5 pH 测定
• 4.1.6 亚硝酸盐含量的测定
• 4.1.7 乳酸菌抑菌特性的研究
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 乳酸菌计数及pH 变化分析
• 4.2.2 亚硝酸盐含量测定结果
• 4.2.3 乳酸菌抑菌试验结果
• 4.3 讨论
• 4.4 本章小节
• 5 结论和建议
• 5.1 实验结论
• 5.2 存在的问题与不足
• 5.3 进一步研究的建议
• 参考文献
• 在学研究成果
• 致谢